Molekulare Grundlagen und Designprinzipien der schaltbaren Front

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4056 (2023) Diesen Artikel zitieren

969 Zugriffe

7 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Während der Zellmigration wird die Vorne-Hinten-Polarität räumlich-zeitlich reguliert; Das zugrunde liegende Design regulatorischer Interaktionen variiert jedoch. In stäbchenförmigen Myxococcus xanthus-Zellen reguliert ein räumlicher Kippschalter dynamisch die Polarität von vorne nach hinten. Das Polaritätsmodul stellt die Polarität von vorne nach hinten her, indem es die vordere Pollokalisierung der kleinen GTPase MglA gewährleistet. Umgekehrt verursacht das chemosensorische Frz-System durch Einwirkung auf das Polaritätsmodul Polaritätsumkehrungen. Die MglA-Lokalisierung hängt von den RomR/RomX-GEF- und MglB/RomY-GAP-Komplexen ab, die sich durch unbekannte Mechanismen asymmetrisch zu den Polen lokalisieren. Hier zeigen wir, dass RomR und die Roadblock-Domänenproteine ​​MglB und MglC eine positive Rückkopplung erzeugen, indem sie einen RomR/MglC/MglB-Komplex bilden und so den hinteren Pol mit hoher GAP-Aktivität etablieren, der für MglA nicht permissiv ist. MglA an der Vorderseite greift in eine negative Rückkopplung ein, die die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB allosterisch unterbricht und so eine geringe GAP-Aktivität an diesem Pol gewährleistet. Diese Erkenntnisse entschlüsseln die Designprinzipien eines Systems zur umschaltbaren Front-Hinten-Polarität.

Die Zellpolarität mit der asymmetrischen Lokalisierung von Proteinen im Zellraum ist allgegenwärtig und grundlegend für viele Zellfunktionen, einschließlich Wachstum und Motilität1,2,3. Dennoch ist kaum verstanden, wie Polarität auf zellulärer Ebene aus lokalen Protein-Protein-Wechselwirkungen entsteht und wie sie dynamisch gesteuert wird. Polaritätsregler werden oft verbunden, um Netzwerke zu erzeugen, die positive Rückkopplung, negative Rückkopplung und/oder gegenseitige Hemmung beinhalten2,4,5,6,7. Bei der Transkriptionsregulation ist es allgemein bekannt, dass unterschiedliche Designs von Regulierungskreisen zu funktionell gleichwertigen Ergebnissen führen können, z. B. ist eine doppelt negative Regulierung funktionell gleichwertig mit einer doppelt positiven Regulierung8. Ebenso können polaritätsregulierende Netzwerke mit funktional äquivalenten Ergebnissen unterschiedliche Designs haben, was die Frage aufwirft, warum ein bestimmtes Netzwerkdesign ausgewählt wurde.

Ein wiederkehrendes Thema in polaritätsregulierenden Systemen ist die Lokalisierung der aktiven GTP-gebundenen Form einer kleinen GTPase an einer einzelnen intrazellulären Stelle6,7,9,10,11,12. Die GTPase wiederum interagiert mit nachgeschalteten Effektoren, um eine spezifische Reaktion auszulösen. Diese GTPasen sind molekulare Schalter, die zwischen einer inaktiven, GDP-gebundenen und einer aktiven, GTP-gebundenen Konformation wechseln13. Der Aktivierungs-/Deaktivierungszyklus wird durch einen verwandten Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) reguliert, der den Austausch von GDP gegen GTP erleichtert, und durch ein GTPase-aktivierendes Protein (GAP), das die niedrige intrinsische GTPase-Aktivität stimuliert14. Zwei experimentell und theoretisch gut untersuchte Systeme veranschaulichen, wie polaritätsregulierende Netzwerke mit unterschiedlichem Design zu gleichwertigen Ergebnissen führen können. Bei Saccharomyces cerevisiae, denen die kleine GTPase Rsr1 fehlt, hängt die Lage der einzelnen Knospenstelle davon ab, wo die GTPase Cdc42 spontan einen einzelnen Cluster auf der Membran bildet. Das zuständige Regulierungsnetzwerk konzentriert sich auf mindestens eine positive Rückmeldung, die Cdc424,9 direkt betrifft. Kurz gesagt, Cdc42-GTP bildet spontan einen Cluster auf der Membran und rekrutiert dann einen Komplex, der den GEF Cdc249 enthält. Da Cdc24 zusätzliches Cdc42 aktiviert, stimuliert die Rekrutierung von Cdc24 die Akkumulation von zusätzlichem Cdc42-GTP und schließt die positive Rückkopplung9. Cdc42-GAPs hemmen das Wachstum von Cdc42-Clustern und können Teil einer negativen Rückkopplung sein9,15,16. Im alternativen System hängt die unidirektionale Wanderung der stäbchenförmigen Zellen des Bakteriums Myxococcus xanthus von der Lokalisierung der GTPase MglA am vorderen Vorderpol ab. In diesem Fall betrifft die positive Rückmeldung nicht MglA, sondern das GAP MglB und das RomR-Gerüst17. Letztendlich bilden diese beiden Proteine ​​einen hinteren, nacheilenden Pol mit hoher GAP-Aktivität, so dass nur der gegenüberliegende Pol für die Rekrutierung von MglA-GTP17 frei bleibt. Somit erzeugen beide Systeme einen einzigen Cdc42/MglA-Cluster. Hier konzentrieren wir uns auf die mechanistischen Grundlagen der Polaritätsbildung in M. xanthus und die funktionellen Eigenschaften, die das zugrunde liegende Netzwerk im Vergleich zum Schaltkreis verleiht, der die Bildung von Cdc42-Clustern bewirkt.

M. xanthus wandert unidirektional auf Oberflächen und nutzt dabei zwei Bewegungsmaschinen, die sich am führenden Pol11,18,19 zusammenfinden. Als Reaktion auf die Signale des chemosensorischen Frz-Systems kehren Zellen die Bewegungsrichtung um20. Während der Umkehrung kehren die Zellen ihre Polarität um und der Pol, an dem die Bewegungsmaschinen montiert sind, wechselt21,22. Motilität und ihre Regulierung durch das Frz-System sind für die mehrzellige Morphogenese mit der Bildung von Raubkolonien und sporengefüllten Fruchtkörpern von wesentlicher Bedeutung11,18,19. Aktives MglA-GTP stimuliert die Montage der Motilitätsmaschinen am führenden Zellpol23,24,25. Die Polarität von vorne nach hinten wird dynamisch durch zwei miteinander verbundene Proteinmodule reguliert, nämlich das Polaritätsmodul und das chemosensorische Frz-System, die in Kombination einen räumlichen Kippschalter erzeugen19. Das Polaritätsmodul stellt die voreilende/nacheilende Polaritätsachse her und umfasst neben MglA vier Proteine, die sich ebenfalls asymmetrisch an den Zellpolen lokalisieren (Abb. 1a). Das homodimere Roadblock-Domänenprotein MglB allein weist GAP-Aktivität auf und bildet zusammen mit seinem niedrigaffinen Co-GAP RomY den MglB/RomY-Komplex mit noch höherer GAP-Aktivität26,27,28. RomX allein weist GEF-Aktivität auf und bildet den RomR/RomX-Komplex mit noch höherer GEF-Aktivität und dient außerdem als polarer Rekrutierungsfaktor für MglA-GTP29.

a Schematische Darstellung der Lokalisierung der Polaritätsproteine. T4P gibt den führenden Pol an. Die Kreisgröße gibt die relative Menge eines Proteins an einem Pol an. Farbcode wie in Abb. 1b. b Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Polaritätsproteinen. Das gestrichelte Kästchen zeigt das positive Feedback von RomR/MglB an. c Die polare Lokalisierung von MglA, MglB und RomR hängt von MglC ab. Alle Fusionsproteine ​​wurden von ihrem nativen Locus aus synthetisiert. In den Diagrammen sind die Pole mit dem höchsten und niedrigsten polaren Fluoreszenzanteil als Pol 1 bzw. Pol 2 definiert. Gefüllte Kreise geben den mittleren Anteil der Fluoreszenz an jedem Pol an. Die Streuung der Einzelzellmessungen wird durch Fehlerbalken und Ellipsen (farbige gestrichelte Linien) dargestellt. Schwarze gestrichelte Linien, Symmetrielinien; graue gestrichelte Linien, Richtlinien, die den Anteil der gesamten polaren Fluoreszenz angeben. Anzahl der analysierten Zellen (n), angegeben in der oberen rechten Ecke. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erzielt; Es werden Daten aus einem Experiment angezeigt. Die Genotypen mglA, mglB, mglC und romR werden mit A, B, C bzw. R angegeben. Schematische Darstellung rechts, beobachtete Effekte. d MglC-mVenus lokalisiert sich asymmetrisch und dynamisch an den Zellpolen. Die Fusion wurde vom nativen Locus aus synthetisiert. Die Zellen wurden in 30-Sekunden-Intervallen abgebildet. 200 Zellen wurden in zwei unabhängigen Experimenten abgebildet; Es wird eine repräsentative Zelle angezeigt. Maßstabsbalken, 1 μm. Die polare Lokalisierung von MglC hängt teilweise von MglB und stark von RomR ab. Es wurden Experimente durchgeführt und die Daten wie in Abb. 1c dargestellt. f Quantifizierung der polaren Lokalisierung von MglC-mVenus, MglB-mCherry und RomR-mCherry in Abwesenheit von MglA. Es wurden Experimente durchgeführt und die Daten wie in Abb. 1c dargestellt. g MglC ist eine Komponente des positiven Feedbacks von RomR/MglC/MglB (gestrichelte Box). H. MglC ist für die Herstellung der korrekten RomR-Polarität unerlässlich. Die Zellen wurden wie in Abb. 1d abgebildet und die Anteile der Zellen mit dem hellsten Cluster am führenden oder nacheilenden Pol bestimmt. Linkes Feld, Zusammenfassung der Zellfraktionen mit dem angegebenen Lokalisierungsmuster. Die Gesamtzahl der Zellen in drei unabhängigen Experimenten ist oben angegeben. Rechtes Feld, Quantifizierung der RomR-mCherry-Lokalisierung in sich bewegenden Zellen.

Experimente und mathematische Modellierung haben eine komplexe Reihe regulatorischer Wechselwirkungen zwischen den Proteinen des Polaritätsmoduls aufgedeckt17,26,27,28,29,30,31,32 (Abb. 1b). Das RomR-Gerüst liegt der polaren Lokalisierung aller anderen Polaritätsproteine ​​zugrunde und verstärkt auch seine eigene polare Lokalisierung, wodurch eine positive Rückkopplung entsteht17. RomR geht durch einen unbekannten Mechanismus auch eine positive Rückkopplung mit MglB ein17. Darüber hinaus rekrutiert RomR direkt RomX, um den RomR/RomX GEF-Komplex zu bilden29. Hohe Konzentrationen von polarem MglB stimulieren die polare Rekrutierung seines Interaktionspartners RomY28 mit niedriger Affinität. Am RomR-Knoten des positiven RomR/MglB-Feedbacks fördert RomR/RomX die polare MglA-GTP-Rekrutierung (Abb. 1b – Verbindung von RomR/RomX zu MglA)29 und am MglB-Knoten hemmt MglB/RomY die polare MglA-GTP Rekrutierung (Abb. 1b – Verbindung von MglB/RomY zu MglA)26,27,28. Schließlich stört MglA-GTP die positive Rückkopplung von RomR/MglB durch einen unbekannten Mechanismus (Abb. 1b – Verbindung von MglA zum gestrichelten Kasten)17. Es wird vermutet, dass diese Wechselwirkungen zusammen zu den entstehenden Eigenschaften des Systems führen (Abb. 1a, b)17,28. Kurz gesagt, am Pol mit der höchsten RomR-Konzentration erzeugt die positive Rückkopplung von RomR/MglB einen Pol mit hohen Konzentrationen von RomR/RomX und MglB/RomY. Aufgrund des Vorhandenseins des MglB/RomY-Komplexes dominiert die GAP-Aktivität an diesem Pol die GEF-Aktivität, wodurch die MglA-GTP-Rekrutierung gehemmt wird und dieser Pol zum nacheilenden Pol wird. Am entgegengesetzten Pol dominiert die RomR/RomX-GEF-Aktivität gegenüber der GAP-Aktivität, da die niedrige Konzentration von MglB nicht ausreicht, um RomY28 zu rekrutieren. Folglich wird MglA-GTP an diesen Pol rekrutiert und beteiligt sich an der negativen Rückkopplung, um die positive Rückkopplung von RomR/MglB zu hemmen und so die niedrige Konzentration der anderen Polaritätsregulatoren sicherzustellen. Das Frz-System ist das zweite Modul des räumlichen Kippschalters, und das Polaritätsmodul ist das nachgeschaltete Ziel dieses Systems. Die Frz-Signalisierung bewirkt durch einen unbekannten Mechanismus die Umkehrung der Polarität der Proteine ​​des Polaritätsmoduls und legt damit den Grundstein für den Aufbau der Motilitätsmaschinerie am neuen Führungspol30,31,33,34.

Unter den Wechselwirkungen der Proteine ​​des Polaritätsmoduls sind die positive Rückkopplung von RomR auf sich selbst, die positive Rückkopplung von RomR/MglB und die hemmende Wirkung von MglA-GTP auf diese positive Rückkopplung nur unzureichend verstanden. MglC ist auch ein homodimeres Roadblock-Domänenprotein35,36,37 und ist durch einen unbekannten Mechanismus an der Regulierung der Zellpolarität beteiligt36. Da MglC mit RomR und MglB35,36 interagiert, war MglC ein Kandidat für die positive Rückmeldung von RomR/MglB.

Hier zeigen wir, dass MglC einen Komplex mit RomR und MglB bildet und dadurch eine positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB herstellt und dass MglA-GTP diese positive Rückkopplung hemmt, indem es die Wechselwirkung zwischen den Roadblock-Domänenproteinen MglC und MglB unterbricht. Darüber hinaus zeigen wir, dass die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB den Grundstein für eine umschaltbare Polarität legt.

Um die Funktion von MglC in Bezug auf die Polarität zu untersuchen, haben wir die Motilitätsdefekte eines Mutanten mit einer In-Frame-Deletion von mglC (ΔmglC) neu charakterisiert. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen 36 weist die ΔmglC-Mutante in bevölkerungsbasierten Motilitätstests Defekte sowohl im Gleiten als auch in der T4P-abhängigen Motilität auf, und die ektopische Expression von mglC ergänzte diese Defekte (ergänzende Abbildung 1a, b). In einzelzellbasierten Motilitätstests (ergänzende Abbildung 1c) und im Einklang mit früheren Beobachtungen , bewegten sich ΔmglC-Zellen für beide Motilitätssysteme mit der gleichen Geschwindigkeit wie Wildtyp (WT); Ähnlich wie bei der ΔfrzE-Negativkontrolle, der die FrzE-Kinase fehlt, hatten ΔmglC-Zellen jedoch eine deutlich geringere Umkehrfrequenz als WT.

Um zu unterscheiden, ob die ΔmglC-Mutante nicht auf Frz-Signale reagiert oder eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber diesen aufweist, haben wir WT- und ΔmglC-Zellen mit dem kurzkettigen Alkohol Isoamylalkohol (IAA) behandelt, der die Umkehrungen in FrzE-abhängiger Weise stark stimuliert. WT und der ΔmglC-Mutant reagierten ähnlich auf 0,3 % IAA mit der Bildung von Kolonien mit glatten Rändern und ohne sichtbare Ausläufer auf 0,5 % Agar, was für die T4P-abhängige Motilität optimal ist, und wenigen Einzelzellen am Rand auf 1,5 % Agar. Dies ist optimal für die Gleitmotilität (ergänzende Abbildung 1a). Solche glatten Kolonieränder weisen auf eine hohe Umkehrhäufigkeit hin20,39. Wir kommen zu dem Schluss, dass die ΔmglC-Mutante per se keinen Motilitätsdefekt, sondern eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Frz-Signalen aufweist, was zu einer verringerten Umkehrfrequenz führt.

Da das Polaritätsmodul das nachgeschaltete Ziel des Frz-Systems ist, haben wir die polare Lokalisierung aktiver, fluoreszierend markierter Fusionen der Polaritätsproteine ​​in Abwesenheit von MglC quantifiziert. Da die Lokalisierung von RomX der von RomR29 folgt und die Lokalisierung von RomY der höchsten Konzentration von MglB28 folgt, verwendeten wir die Lokalisierung von RomR und MglB als Messwerte für die Lokalisierung des RomR/RomX-Komplexes bzw. des MglB/RomY-Komplexes.

In Schnappschüssen von ΔmglC-Zellen (Abb. 1c) war die polare Lokalisierung von MglA-mVenus und MglB-mCherry stark reduziert, während die polare Lokalisierung von RomR-mCherry nur teilweise verloren ging. MglA, MglB und RomR akkumulierten unabhängig von MglC (ergänzende Abbildung 1d).

Um die MglC-Lokalisierung zu untersuchen, beobachteten wir zunächst, dass eine vollständig aktive MglC-mVenus-Fusion, die von der nativen Stelle exprimiert wurde (ergänzende Abbildung 1a, b), in einem bipolaren asymmetrischen Muster mit einem großen Cluster am nacheilenden Pol in WT-Zellen lokalisiert war und dabei die Polarität wechselte Umkehrungen (Abb. 1d). Das bipolare asymmetrische Muster war auch in Schnappschüssen erkennbar (Abb. 1e). In Abwesenheit von MglA war MglC-mVenus polarer (Abb. 1e). In Abwesenheit von MglB ging die polare Lokalisierung von MglC-mVenus jedoch teilweise verloren; und in Abwesenheit von RomR ging es fast vollständig verloren (Abb. 1e). MglC-mVenus akkumulierte unabhängig von MglA, MglB und RomR (ergänzende Abbildung 1e). Somit hemmt MglA die polare Lokalisierung von MglC, während MglC teilweise von MglB und stark von RomR abhängt. Bemerkenswert ist, dass MglB in Abwesenheit von RomR keine signifikante polare MglC-Lokalisierung unterstützt.

Da die Interpretation der Ergebnisse für die polare Lokalisierung von MglC, MglB und RomR aufgrund der hemmenden Wirkung von MglA-GTP auf die positive Rückkopplung von RomR/MglB schwierig sein kann, haben wir deren polare Fluoreszenz in Stämmen ohne MglA quantifiziert.

Die polare MglC-mVenus-Lokalisierung in der ΔmglAΔmglB-Mutante ging im Vergleich zur ΔmglA-Mutante teilweise verloren, war in der ΔmglAΔromR-Mutante fast vollständig aufgehoben und in der dreifachen ΔmglAΔmglBΔromR-Mutante vollständig aufgehoben (Abb. 1f). Diese Beobachtungen bestätigen, dass die polare Lokalisierung von MglC-mVenus teilweise von MglB und stark von RomR abhängt. Sie bestätigen auch, dass MglB in Abwesenheit von RomR die polare Lokalisierung von MglC nicht wesentlich unterstützt.

Die polare Lokalisierung von MglB-mCherry in den Mutanten ΔmglAΔmglC, ΔmglAΔromR und ΔmglAΔmglCΔromR ging fast vollständig verloren (Abb. 1f). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die polare Lokalisierung von MglB-mCherry stark von MglC und, wie bereits gezeigt17, von RomR abhängt. Darüber hinaus können weder MglC noch RomR allein eine effiziente polare MglB-mCherry-Lokalisierung etablieren.

Die polare Lokalisierung von RomR-mCherry wurde in den Mutanten ΔmglAΔmglB, ΔmglAΔmglC und ΔmglAΔmglBΔmglC teilweise aufgehoben (Abb. 1f). Daher sind sowohl MglB als auch MglC wichtig, aber nicht wesentlich für die polare RomR-Lokalisierung. Darüber hinaus können MglB und MglC nur dann die polare RomR-Lokalisierung weiter stimulieren, wenn beide vorhanden sind.

Diese Beobachtungen zeigen, dass RomR allein polar lokalisiert, und sie unterstützen, dass RomR MglC rekrutiert, das dann MglB rekrutiert. Die Beobachtungen, dass (1) MglB die polare Lokalisierung von MglC in Gegenwart von RomR stimuliert und (2) MglB zusammen mit MglC die polare Lokalisierung von RomR stimuliert, belegen, dass die drei Proteine ​​eine positive Rückkopplung aufbauen, die ihre polare Lokalisierung verstärkt (Abb. 1g). Diese Beobachtungen legen auch nahe, dass die zuvor festgestellte positive Rückkopplung von RomR/MglB von MglC abhängt, dh MglC hilft, eine positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB zu erzeugen, indem es zwischen RomR und MglB wirkt (Abb. 1g). Da MglA die positive Rückkopplung von RomR/MglB hemmt, erklärt dieses Modell auch die Beobachtung, dass MglA die polare Lokalisierung von MglC hemmt (Abb. 1e). Darüber hinaus ist die verringerte polare MglA-Lokalisierung in Abwesenheit von MglC (Abb. 1c) ein direktes Ergebnis der verringerten polaren RomR-Lokalisierung in Abwesenheit von MglC (Abb. 1c, f).

Um die Idee des positiven Feedbacks von RomR/MglC/MglB weiter zu testen, nutzten wir einen etablierten Ansatz zur Überwachung der kooperativen Polarrekrutierung von RomR-mCherry17. Bei diesem Ansatz steuert ein Vanillate-induzierbarer Promotor die romR-mCherry-Expression; Nach der Induktion wird die Pollokalisierung von RomR-mCherry durch Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie verfolgt. Um die RomR-mCherry-Synthese im Laufe der Zeit zu überwachen, schätzen wir die RomR-mCherry-Konzentration in einzelnen Zellen, die als Fluoreszenzkonzentration bezeichnet wird, indem wir die gesamte zelluläre Fluoreszenz messen und dann anhand der Zellfläche normalisieren, die wir als Proxy für das Zellvolumen verwenden.

Nach der Induktion der romR-mCherry-Expression in der ΔmglAΔmglBΔromRΔmglC-Vierfachmutante (ergänzende Abbildung 2a) und der ΔmglAΔromRΔmglC-Dreifachmutante (ergänzende Abbildung 2b) lokalisierte sich RomR-mCherry bei allen Fluoreszenzkonzentrationen asymmetrisch zu den Polen und folgte quantitativ dem zuvor beobachteten Muster die ΔmglAΔmglBΔromR-Dreifachmutante (ergänzende Abbildung 2c). Wie beschrieben 17, liefern die Beobachtungen, dass die Anteile von RomR-mCherry an beiden Polen mit der Fluoreszenzkonzentration bei niedrigen Induktionsniveaus zunehmen, Hinweise auf eine positive Kooperativität bei der polaren Lokalisierung von RomR-mCherry (ergänzende Abbildung 2a – d). Da die polare Lokalisierung von RomR-mCherry in diesen drei Stämmen quantitativ ähnlich ist, schließen wir, dass MglC, ähnlich wie MglB, für die positive Rückkopplung von RomR auf sich selbst nicht wesentlich ist. Im Gegensatz dazu war in der ΔmglAΔromR-Doppelmutante die Pollokalisierung von RomR-mCherry erhöht und asymmetrischer, wobei der hellere Pol einen größeren Anteil der RomR-mCherry-Fluoreszenz ausmachte (ergänzende Abbildung 2d). Diese Beobachtung bestätigt, dass MglC für die Etablierung des positiven Feedbacks von RomR/MglB wesentlich ist und dass das positive Feedback von RomR/MglB tatsächlich ein positives Feedback von RomR/MglC/MglB ist (Abb. 1g).

Das Modell zur Polaritätsfeststellung (Abb. 1g) sagt voraus, dass in Abwesenheit von MglC und daher der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB das verbleibende polare RomR zusammen mit RomX MglA-GTP rekrutiert. Infolgedessen haben MglA-GTP und RomR/RomX ihre höchste polare Fluoreszenz am Vorderpol. Um diese Vorhersage zu testen, führten wir eine Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie sich bewegender Zellen durch. Im WT war MglA-mVenus in den meisten Zellen mit einem großen Cluster am führenden Pol und RomR-mCherry mit einem großen Cluster am nacheilenden Pol lokalisiert (Abb. 1h). Wichtig und wie vorhergesagt war, dass MglA-mVenus und RomR-mCherry in der ΔmglC-Mutante in den meisten Zellen ihre höchste polare Fluoreszenz am führenden Pol aufwiesen (Abb. 1h). Wir kommen zu dem Schluss, dass MglC nicht nur für die polare Lokalisierung von MglA, MglB und RomR wichtig ist, sondern auch für die Festlegung der korrekten Polarität von RomR-mCherry.

Um den Mechanismus zu untersuchen, der der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB zugrunde liegt, haben wir mithilfe von Pulldown-Experimenten in vitro mit gereinigten Proteinen direkte Wechselwirkungen zwischen RomR, MglC, MglB und MglA getestet. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen in In-vitro-Pulldown-Experimenten35 und Bakterial Adenylate Cyclase-Based Two-Hybrid (BACTH)-Assays36 zog Strep-MglC His6-MglB und MalE-RomR in paarweisen Kombinationen herunter, nicht jedoch MglA-His6, das mit vorbeladen war GTP (Abb. 2a; ergänzende Abb. 3a). In paarweisen Kombinationen unter Verwendung von MalE-RomR als Köder zog MalE-RomR Strep-MglC herunter, nicht jedoch His6-MglB; Insbesondere zog RomR-MalE in Gegenwart aller drei Proteine ​​sowohl Strep-MglC als auch His6-MglB herunter (Abb. 2b; ergänzende Abb. 3b). Schließlich zog His6-MglB in paarweisen Kombinationen Strep-MglC herunter, aber nicht MalE-RomR; In Gegenwart aller drei Proteine ​​​​zogen His6-MglB jedoch sowohl Strep-MglC als auch MalE-RomR herunter (Abb. 2c; ergänzende Abb. 3c).

a–c Proteine ​​wurden in Endkonzentrationen von 10 µM gemischt und auf die angegebenen Matrizen aufgetragen. Die Matrizen wurden gewaschen und die gebundenen Proteine ​​eluiert. Das Köderprotein wird durch den schwarzen Kreis angezeigt. In Experimenten mit MglA-His6 war das Protein mit GTP vorbeladen und alle Puffer enthielten 40 µM GTP. Äquivalente Volumina der Ladung (L), der letzten Wäsche (W) und des Eluats (E) wurden auf demselben SDS-PAGE-Gel getrennt und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt. Lücken zwischen den Spuren weisen darauf hin, dass Spuren zu Präsentationszwecken gelöscht wurden. Die berechneten Molekularmassen der angegebenen Proteine ​​sind rechts und die Molekulargewichtsmarkierungen (M) links angegeben. In den Diagrammen rechts ist eine direkte Interaktion mit dem Köder durch einen schwarzen und eine indirekte Interaktion durch einen gestrichelten Pfeil gekennzeichnet. Bei Proben mit MalE-RomR sind die schneller wandernden Proteine ​​Abbauprodukte. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erzielt.

Als nächstes haben wir festgestellt, ob MglC und/oder RomR/MglC MglA-GAP-Aktivität aufweisen oder die MglB- und/oder MglB/RomY-GAP-Aktivität beeinträchtigen. Zu diesem Zweck haben wir die MglA-His6-GTPase-Aktivität in Gegenwart von RomR, MglC, MglB und/oder RomY bestimmt. Weder Strep-MglC noch MaleE-RomR/Strep-MglC beeinflussten die MglA-GTPase-Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von MglB-His6 und/oder Strep-RomY (ergänzende Abbildung 4).

Wir kommen zu dem Schluss, dass RomR, MglC und MglB interagieren und einen Komplex bilden, in dem MglC zwischen RomR und MglB eingebettet ist.

Um die strukturelle Basis für die RomR→MglC→MglB-Wechselwirkungen aufzuklären, nutzten wir Strukturinformationen für MglA, MglB und MglC35,40,41,42. Jedes MglB-Protomer im Homodimer besteht aus einem fünfsträngigen β-Faltblatt, das zwischen der α2-Helix und den α1/α3-Helices40 liegt. Im Dimer erzeugen die α2-Helices die sogenannte Zwei-Helix-Seite und die Paare der α1/α3-Helices die sogenannte Vier-Helix-Seite (Abb. 3a). In der kristallographischen Struktur des MglA-GTPɣS:MglB2-Komplexes interagiert das MglA-Monomer asymmetrisch mit der Zwei-Helix-Seite des MglB-Dimers40,41,42.

a Kristallographische Struktur des MglB-Dimers (PDB-ID: 6hjm40), betrachtet von der Zwei-Helix- und der Vier-Helix-Seite. Untere Felder, Oberflächendarstellung des MglB-Dimers basierend auf dem elektrostatischen Oberflächenpotential, konturiert von +5 bis −5 kT e−1. Die K14-, R115- und K120-Reste sind auf der Vier-Helix-Seite rot und die entsprechenden positiv geladenen Oberflächenbereiche durch schwarze Kreise in den elektrostatischen Oberflächenpotentialdiagrammen gekennzeichnet. b Die MglBKRK-Variante interagiert nicht mit MglC. Das Pulldown-Experiment wurde mit His6-MglBKRK als Köder auf dem angegebenen Harz durchgeführt und die Daten sind wie in Abb. 2 dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erhalten. C. MglBKRK-mCherry hat die polare Lokalisierung reduziert. Zum Vergleich ist MglBWT-mCherry enthalten (roter Punkt). MglBKRK-mCherry wurde aus dem nativen Locus synthetisiert. d MglBKRK führt zu einer verringerten polaren Lokalisierung von MglA, MglC und RomR. Zum Vergleich ist die Lokalisierung der drei Fusionsproteine ​​in Gegenwart von MglBWT enthalten (gelbe, braune und grüne Punkte). MglBKRK wurde aus dem nativen Locus synthetisiert. In c–d wurden Experimente durchgeführt und die Daten wie in Abb. 1c dargestellt.

Galizien et al. berichteten, dass die K14-, R115- und K120-Reste in MglB in MglB-Homologen hoch konserviert sind und in der gelösten Struktur des MglB-Dimers oberflächenexponiert sind, was zwei positiv geladene Oberflächenbereiche auf der Vierhelix-Seite des MglB-Dimers40 erzeugt (Abb. 3a). . Darüber hinaus berichteten sie, dass die MglBK14A R115A K120A-Variante (im Folgenden MglBKRK) mit Substitutionen dieser drei positiv geladenen Reste durch Ala in vitro immer noch GAP-Aktivität aufweist, in vivo jedoch durch einen unbekannten Mechanismus diffus lokalisiert wird40. Da sich MglB in Abwesenheit von MglC diffus lokalisiert, stellten wir daher die Hypothese auf, dass die positiv geladenen Oberflächenregionen im MglB-Dimer, die durch die Reste K14, R115 und K120 definiert werden, an der Wechselwirkung zwischen MglB und MglC beteiligt sein könnten.

In In-vitro-Pulldown-Experimenten konnte His6-MglBKRK Strep-MglC nicht nachweisbar binden (Abb. 3b). Konsistent war die polare Lokalisierung von MglBKRK-mCherry in ansonsten WT-Zellen unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von MglC und MglA stark reduziert (Abb. 3c; ergänzende Abb. 5a). Im umgekehrten Experiment verursachte MglBKRK eine starke Verringerung der MglA-mVenus-Lokalisierung, während die polare Lokalisierung von MglC-mVenus und RomR-mCherry teilweise aufgehoben wurde (Abb. 3d; ergänzende Abb. 5a). Wir kommen zu dem Schluss, dass MglBKRK nicht in der Lage ist, mit MglC zu interagieren, und schlagen vor, dass die positiv geladenen KRK-Oberflächenregionen im MglB-Dimer die Schnittstelle zu MglC darstellen, was mit der Annahme von Kapoor et al.35 übereinstimmt. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass die Wirkung der MglBKRK-Variante auf die RomR- und MglA-Lokalisierung durch die Unterbrechung der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB verursacht wird, was zu einer verringerten polaren RomR/RomX-Lokalisierung und folglich zu einer verringerten polaren MglA-Lokalisierung führt.

Die Struktur des MglC-Homodimers ähnelt der von MglB mit zwei Helix- und vier Helix-Seiten (Abb. 4a)35. McLoon et al. berichteten, dass die F25-, D26- und I28-Reste in MglC in MglC-Homologen 36 (ergänzende Abbildung 6) hoch konserviert sind. In der gelösten Struktur des MglC-Dimers sind diese drei Reste oberflächenexponiert und erzeugen zwei getrennte negativ geladene Oberflächenbereiche auf der Zwei-Helix-Seite (Abb. 4a). McLoon et al. berichteten auch, dass die MglCF25A D26A I28A-Variante (im Folgenden MglCFDI) mit Substitutionen dieser drei Reste durch Ala in ihrer Wechselwirkung mit MglB, jedoch nicht mit RomR, basierend auf BACTH-Assays, abgeschafft wurde36. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die beiden negativ geladenen Oberflächenbereiche, die durch die Reste F25, D26 und I28 definiert werden, die Wechselwirkungsschnittstelle von MglC zu MglB darstellen könnten.

a Kristallographische Struktur des MglC-Dimers (PDB-ID: 7CY135), betrachtet von der Zwei-Helix- und der Vier-Helix-Seite. Untere Felder, Oberflächendarstellung des MglC-Dimers basierend auf dem elektrostatischen Oberflächenpotential, konturiert von +5 bis −5 kT e−1. Die F25-, D26- und I28-Reste sowie die K104-, R106- und R110-Reste sind auf der Zwei-Helix- bzw. der Vier-Helix-Seite rot dargestellt, und die entsprechenden negativ und positiv geladenen Oberflächenbereiche sind durch schwarze Kreise in der elektrostatischen Oberfläche gekennzeichnet Potenzialdiagramme. b MglCFDI-mVenus hat eine reduzierte Polarlokalisierung. Zum Vergleich ist MglCWT-mVenus enthalten (brauner Punkt). MglCFDI-mVenus wurde aus dem nativen Locus synthetisiert. c MglCFDI verursacht eine verringerte polare Lokalisierung von MglA, MglB und RomR. Zum Vergleich ist die Lokalisierung der drei Fusionsproteine ​​in Gegenwart von MglCWT enthalten (gelbe, rote und grüne Punkte). MglCFDI wurde ektopisch synthetisiert. d MglCKRR-mVenus weist eine stark reduzierte Polarlokalisierung auf. Zum Vergleich ist MglCWT-mVenus enthalten (brauner Punkt). MglCKRR-mVenus wurde aus dem nativen Locus synthetisiert. e MglCKRR verursacht eine verringerte polare Lokalisierung von MglA, MglB und RomR. Zum Vergleich ist die Lokalisierung der drei Fusionsproteine ​​in Gegenwart von MglCWT enthalten (gelbe, rote und grüne Punkte). MglCKRR wurde ektopisch synthetisiert. Im Folgenden wurden Experimente durchgeführt und die Daten wie in Abb. 1c dargestellt.

Wir wollten zunächst die Wirkung der MglCFDI-Variante auf die MglC/MglB-Wechselwirkung in vitro überprüfen; Allerdings bildete die mit Strep markierte Variante unter allen getesteten Bedingungen Einschlusskörperchen in Escherichia coli, was eine Reinigung unmöglich machte. Wichtig ist, dass MglCFDI-mVenus in M. xanthus löslich war (ergänzende Abbildung 5b); Im Vergleich zu MglC-mVenus akkumulierte es jedoch in einem geringeren Ausmaß (ergänzende Abbildung 5c). Die polare Lokalisierung von MglCFDI-mVenus in ansonsten WT-Zellen ging im Vergleich zu MglC-mVenus teilweise verloren (Abb. 4b). Darüber hinaus änderte sich die polare MglCFDI-mVenus-Lokalisierung nach der Entfernung von MglA oder MglB nicht wesentlich, wurde jedoch durch die Entfernung von RomR aufgehoben (Abb. 4b). Im umgekehrten Experiment akkumulierte MglCFDI wie MglC und verursachte, ähnlich wie die ΔmglC-Mutation, eine starke Verringerung der polaren Lokalisierung von MglA-mVenus und MglB-mCherry, während die polare Lokalisierung von RomR-mCherry nur teilweise aufgehoben wurde (Abb. 4c; ergänzende Abb. 5c). . Wir kommen zu dem Schluss, dass MglCFDI nicht in der Lage ist, mit MglB, jedoch nicht mit RomR, zu interagieren, und schlagen vor, dass die negativ geladenen FDI-Oberflächenbereiche im MglC-Dimer die Schnittstelle zu MglB darstellen. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass die Wirkung der MglCFDI-Variante auf die RomR- und MglA-Lokalisierung durch die Unterbrechung der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB verursacht wird, was zu einer verringerten polaren RomR/RomX-Lokalisierung und folglich zu einer verringerten polaren MglA-Lokalisierung führt, wie beobachtet in der ΔmglC-Mutante.

Zusätzlich zu den FDI-Resten sind die Reste K104, R106 und R110 (MglC-Nummerierung) in MglC-Homologen hoch konserviert (ergänzende Abbildung 6). In der gelösten Struktur des MglC-Dimers sind diese drei Reste auf der Vier-Helix-Seite oberflächenexponiert und definieren einen kontinuierlichen, positiv geladenen, oberflächenexponierten Bereich im Dimer (Abb. 4a). Da diese Region von den FDI-Regionen getrennt ist und MglC parallel mit MglB und RomR interagiert, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die positiv geladene Oberflächenregion, die durch die Reste K104, R106 und R110 definiert wird, die Interaktionsschnittstelle von MglC zu RomR darstellen könnte.

Zu diesem Zweck haben wir MglCK104A R106A R110A-Varianten (im Folgenden MglCKRR) generiert. Allerdings bildete die mit Strep markierte Variante unter allen getesteten Bedingungen Einschlusskörperchen in E. coli, was eine Reinigung unmöglich machte. Wichtig ist, dass MglCKRR-mVenus in M. xanthus löslich war (ergänzende Abbildung 5b) und sich auf dem gleichen Niveau wie MglC-mVenus anreicherte (ergänzende Abbildung 5d). Die polare Lokalisierung von MglCKRR-mVenus in ansonsten WT-Zellen war im Vergleich zu MglC-mVenus stark reduziert (Abb. 4d) und blieb nach Entfernung von MglA, MglB oder RomR stark reduziert (Abb. 4d). Im umgekehrten Experiment akkumulierte MglCKRR wie MglC und verursachte, ähnlich wie die ΔmglC-Mutation und MglCFDI, eine starke Verringerung der polaren Lokalisierung von MglA-mVenus und MglB-mCherry, während die polare Lokalisierung von RomR-mCherry nur teilweise aufgehoben wurde (Abb. 4e; ergänzende Abb. 5d). Basierend auf diesen Beobachtungen kommen wir zu dem Schluss, dass MglCKRR nicht in der Lage ist, mit RomR zu interagieren, und schlagen vor, dass die beiden positiv geladenen KRR-Oberflächenregionen im MglC-Dimer die Schnittstelle zu RomR darstellen. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass die Wirkung der MglCKRR-Variante auf die MglA-Lokalisierung durch die Unterbrechung der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB verursacht wird, wie sie bei den ΔmglC- und mglCFDI-Mutanten beobachtet wird.

RomR-Homologe bestehen aus einer N-terminalen Empfängerdomäne von Reaktionsregulatoren, einer intrinsisch ungeordneten Region (IDR) und einer α-helikalen, negativ geladenen Glu-reichen Region am C-Terminus (im Folgenden RomRC) (Abb. 5a)30. In BACTH-Assays interagiert RomRC mit MglC36. Um zu untersuchen, ob RomRC die einzige Schnittstelle zu MglC ist, haben wir eine RomR1–368-Variante ohne RomRC und eine Variante, die nur RomRC enthält, generiert.

a Domain-Architektur und Kostenpunkt von RomR. Der Ladungswert wurde mithilfe eines gleitenden Fensters von 20 Resten berechnet. b MP-Analyse von MalE-RomR, MalE-RomR1-368 und MalE-RomRC. Die den jeweiligen Gaußschen Anpassungen entsprechenden Molekülmassen werden in kDa über den angepassten Kurven angezeigt. Die berechneten Molekülmassen der monomeren, dimeren und trimeren MalE-RomR-Varianten sind zusammen mit den Symbolen der oligomeren Zustände in Klammern angegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erzielt. c RomRC interagiert mit MglC, RomR1–368 jedoch nicht. Das Pulldown-Experiment wurde mit Strep-MglC als Köder auf dem angegebenen Harz durchgeführt und wie in Abb. 2 dargestellt. Die mehreren Banden unter MalE-RomRC und MalE-RomR1–368 sind Abbauprodukte. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erzielt. d RomR1–368-mCherry weist eine stark reduzierte Polarlokalisierung auf. Zum Vergleich ist RomRWT-mCherry enthalten (grüner Punkt). RomR1–368-mCherry wurde aus dem nativen Locus synthetisiert. e RomR1–368 bewirkt eine stark reduzierte polare Lokalisierung von MglA, MglB und MglC. Zum Vergleich ist die Lokalisierung der drei Fusionsproteine ​​in Gegenwart von RomRWT (gelbe, rote und braune Punkte) enthalten. RomR1–368 wurde aus dem nativen Locus synthetisiert. f RomRC-mCherry lokalisiert polar. Zum Vergleich ist RomRWT-mCherry enthalten (grüner Punkt). RomRC-mCherry wurde ektopisch synthetisiert. In df wurden Experimente durchgeführt und die Daten wie in Abb. 1c dargestellt.

Zunächst untersuchten wir mithilfe der Massenphotometrie (MP) die oligomere Struktur von RomR. Wir haben MalE-RomR entdeckt, dessen Massen gut mit Monomeren, Dimeren und Trimeren übereinstimmen (Abb. 5b). MalE-RomRC wurde auch mit Massen nachgewiesen, die gut mit Monomeren, Dimeren und Trimeren übereinstimmten, während MalE-RomR1–368 nur mit Massen nachgewiesen wurde, die mit Monomeren übereinstimmten (Abb. 5b). Trimeres MalE-RomR war bei 50 nM häufiger als bei 25 nM, während trimeres MalE-RomRC bei 25 nM und 50 nM gleichermaßen vorhanden war (Abb. 5b). Wir kommen zu dem Schluss, dass RomRC für die RomR-Oligomerisierung erforderlich und ausreichend ist und dass die Empfängerdomänen und die IDRs nicht interagieren. Darüber hinaus belegen diese Ergebnisse, dass sich RomR zu Trimeren bildet und RomR in voller Länge unterhalb von 50 nM zu Dimeren zu dissoziieren beginnt. Basierend auf der quantitativen Immunblot-Analyse enthält eine M. xanthus-Zelle ~6000 ± 2000 RomR-Moleküle (ergänzende Abbildung 5e), was zu einer zellulären RomR-Konzentration von ~2,5 ± 0,8 µM führt. Wir schlagen daher vor, dass RomR in vivo überwiegend als Trimer vorliegt.

In Pulldown-Experimenten interagierte MalE-RomR1–368 nicht nachweisbar mit Strep-MglC, während dies bei MalE-RomRC der Fall war (Abb. 5c). In M. xanthus akkumulierte RomR1–368-mCherry auf dem gleichen Niveau wie RomR-mCherry (ergänzende Abbildung 5f), die polare Lokalisierung in ansonsten WT-Zellen wurde jedoch aufgehoben (Abb. 5d). Im umgekehrten Experiment akkumulierte RomR1–368 wie RomR und verursachte, ähnlich wie die ΔromR-Mutation, starke Verringerungen der polaren Lokalisierung von MglA-mVenus, MglB-mCherry und MglC-mVenus (Abb. 5e17, 30, 31; ergänzende Abb. 5f). RomRC-mCherry akkumulierte, selbst wenn es vom starken pilA-Promotor exprimiert wurde, in einem stark reduzierten Ausmaß (ergänzende Abbildung 5f); Wichtig ist, dass die meisten Zellen ein schwaches Polarsignal hatten (Abb. 5f).

Wir kommen zu dem Schluss, dass das negativ geladene RomRC drei Funktionen hat: Es ist für die RomR-Oligomerisierung erforderlich und ausreichend, stellt die RomR-Schnittstelle zu MglC dar und ist für die polare Lokalisierung von RomR erforderlich und zumindest teilweise dafür verantwortlich.

Um strukturelle Einblicke in den RomR/MglC/MglB-Komplex zu gewinnen, verwendeten wir Strukturinformationen35,40,41, unsere Funktionsdaten und AlphaFold-Multimer43,44,45 Strukturvorhersagen, um diesen Komplex zu modellieren. Die AlphaFold-Multimer-Modelle der MglB- und MglC-Dimere wurden mit hoher Sicherheit vorhergesagt und stimmten gut mit den gelösten kristallographischen Strukturen der MglB- und MglC-Dimere überein (ergänzende Abbildung 7a – c), was die Gültigkeit der Strukturvorhersagen dokumentiert.

Eine niedrig aufgelöste Struktur des MglC/MglB-Komplexes belegt, dass ein MglC-Dimer zwei MglB-Dimere bindet35. In AlphaFold-Multimer-Modellen mit derselben Stöchiometrie wird mit hoher Genauigkeit vorhergesagt, dass zwei MglB-Dimere über ihre Vier-Helix-Seiten mit den „lateralen“ Kanten der Zwei-Helix-Seite des MglC-Dimers interagieren, wodurch ein MglC2:(MglB2 entsteht )2-Komplex (Abb. 6a; ergänzende Abb. 7d). In diesem Komplex belegen Pymol-basierte Analysen, dass sich die R115-Reste in den beiden KRK-Regionen eines MglB-Dimers in unmittelbarer Nähe zu D26 und I28 einer MglC-FDI-Region befinden und an deren Kontaktherstellung beteiligt sind (Abb. 6a, Einschub). Somit stimmt dieses Strukturmodell mit einer 2:4-Stöchiometrie des MglC/MglB-Komplexes überein und unterstützt zusammen mit unseren experimentellen Ergebnissen, dass die entgegengesetzt geladenen MglB-KRK- und MglC-FDI-Oberflächenbereiche aneinander grenzen. Wir stellen fest, dass sich die an MglC gebundenen MglB-Dimere strukturell vom isolierten MglB-Dimer unterscheiden, dh die Vier-Helix-Seite befindet sich in einem geschlosseneren Zustand, wenn sie mit MglC2 komplexiert ist (ergänzende Abbildung 7e). Andererseits weist das an MglB gebundene MglC-Dimer nur geringfügige strukturelle Unterschiede zum isolierten Dimer auf (ergänzende Abbildung 7f).

ein AlphaFold-Multimer-Strukturmodell des MglC2:(MglB2)2-Komplexes. Modellrang 1 wird angezeigt. Der Einschub zeigt R115 in jedem der MglB-Protomere zusammen mit den D26- und I28-Resten in einem MglC-Protomer. b MP-Analyse von MalE-MglC (oben) und Mischungen von MglC mit MalE-RomR oder MalE-RomRC. Die den jeweiligen Gaußschen Anpassungen entsprechenden Molekülmassen werden in kDa über den angepassten Kurven angezeigt. Die Gauß-Anpassungen sind entsprechend dem jeweiligen Protein MalE-MglC (braun), MalE-RomR (grün), MalE-RomRC (grün), MalE-RomR:MalE-MglC (lila) und MalE-RomRC:MalE-MglC (lila) gefärbt ). Die blaue Gaußsche Anpassung (unteres Feld) zeigt eine Mischung aus MalE-MglC und MalE-RomRC an. Berechnete Molekularmassen von Monomer- und Dimer-MalE-MglC-, Monomer-, Dimer- und Trimer-MalE-RomR/MalE-RomRC- und MalE-RomR/MalE-RomRC:MalE-MglC-Komplexen mit Stöchiometrien von 2:2 und 3:2 sind in angegeben Klammern zusammen mit Symbolen der oligomeren Zustände. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erzielt. c Schema des RomR/MglC/MglB-Komplexes mit einer 3:2:4-Stöchiometrie. d Messung der In-vivo-Erholungskinetik polarer RomR-mCherry-Cluster in FRAP-Experimenten. Der weiße Kreis im oberen Feld zeigt den gebleichten Bereich von Interesse (ROI) an einem nacheilenden Pol an und die gepunktete Linie zeigt das Bleichereignis an. Unteres Feld: Die normalisierte Fluoreszenzintensität des ROI vor dem Bleichen wurde auf 1,0 eingestellt. Farbige Punkte zeigen den Mittelwert und den Fehlerbalken STDEV an. Dunkle Linien zeigen die an eine einzelne Exponentialfunktion angepasste Erholung. n, Anzahl der Bleichereignisse an einem nacheilenden Pol. Maßstabsbalken, 2 μm. e Zusammenfassung von T1/2 und Fmob. Die Zellen wurden wie in d behandelt, wobei die Cluster am nacheilenden (Lag) oder führenden (Lead) Pol gebleicht wurden. Die Gesamtzahl der Bleichereignisse in drei biologischen Replikaten ist oben aufgeführt. Fehlerbalken, Mittelwert ± STDEV. *P < 0,05, ns, kein signifikanter Unterschied, zweiseitiger Student-T-Test. Die genauen P-Werte sind in der Quelldatendatei aufgeführt.

Um die Stöchiometrie des RomR/MglC-Komplexes zu bestimmen, verwendeten wir MP. Wir haben ein MalE-MglC-Fusionsprotein entdeckt, dessen Massen einem Monomer und einem Dimer entsprechen (Abb. 6b). In Gegenwart von MalE-MglC und MalE-RomR konnten wir zusätzlich zu den Massen der einzelnen Proteine ​​auch Komplexe mit Massen nachweisen, die einer RomR:MglC-Stöchiometrie von 2:2 und 3:2 entsprechen (Abb. 6b; siehe). siehe auch Abb. 5b). In ähnlicher Weise haben wir in Gegenwart von MalE-MglC und MalE-RomRC zusätzliche Peaks mit Massen festgestellt, die einer RomRC:MglC-Stöchiometrie von 2:2 und 3:2 entsprechen (Abb. 6b; siehe auch Abb. 5b).

Um strukturelle Einblicke in die RomR/MglC-Komplexe zu erhalten, haben wir versucht, AlphaFold-Multimer-Strukturmodelle der dimeren und trimeren RomR-, dimeren und trimeren RomRC-, RomR2:MglC2- und RomR3:MglC2- sowie RomRC2:MglC2- und RomRC3:MglC2-Komplexe zu erstellen . Allerdings wurde keiner dieser Komplexe mit hoher Sicherheit vorhergesagt. Insgesamt belegen unsere experimentellen Daten, dass das MglC-Dimer mit dimerem und trimerem RomR interagieren kann und dass die Schnittstelle zwischen MglC und RomR durch die entgegengesetzt geladenen KRR-Regionen im MglC-Dimer und das negativ geladene RomRC im RomR-Dimer und -Trimer dargestellt wird.

Insgesamt belegen diese Daten, dass ein einzelnes MglC-Dimer zwischen zwei MglB-Dimeren und einem RomR-Dimer oder -Trimer eingebettet ist, wodurch ein RomR:MglC:MglB-Komplex mit einer 2:2:4- oder 3:2:4-Stöchiometrie entsteht. Da die quantitative Immunoblot-Analyse (ergänzende Abbildung 5e) bestätigt, dass RomR in vivo überwiegend als Trimer vorliegt, schlagen wir vor, dass die dominante Form des RomR:MglC:MglB-Komplexes in vivo eine 3:2:4-Stöchiometrie aufweist (Abb. 6c). ).

Das Strukturmodell des RomR/MglC/MglB-Komplexes unterstützt ein Modell dafür, wie RomR, MglC und MglB interagieren und wie polares RomR MglC rekrutiert, das wiederum MglB rekrutiert. Aus diesem Modell geht jedoch nicht klar hervor, wie die positive RomR/MglC/MglB-Rückkopplung geschlossen wird. Wir spekulierten, dass diese Schleife geschlossen werden könnte, wenn RomR im Vergleich zu RomR allein stabiler an die Pole im RomR/MglC/MglB-Komplex binden würde. Um eine Metrik für die Stabilität von RomR in polaren Clustern zu erhalten, verwendeten wir FRAP-Experimente (Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching), bei denen polare RomR-mCherry-Cluster gebleicht wurden und die halbmaximale Erholungszeit (T1/2) und die mobile Fraktion (Fmob) erreicht wurden. Wird zur Bewertung des RomR-mCherry-Umsatzes verwendet. Im WT tauschte RomR-mCherry am nacheilenden/führenden Pol dynamisch mit dem Zytoplasma mit T1/2 von 25,7 ± 15,2/17,3 ± 8,6 s, ähnlich den vorherigen Ergebnissen34, und Fmob von 0,7 ± 0,1/0,9 ± 0,1 aus (Abb. 6d). , e). Daher ist der RomR-mCherry-Umsatz am hinteren Pol deutlich langsamer und geringer als am führenden Pol. Diese Beobachtungen stimmen damit überein, dass MglA-GTP am führenden Pol eine negative Rückkopplung auslöst, um die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB zu hemmen. Konsistent war in der unbeweglichen ΔmglA-Mutante, in der führende und nacheilende Pole nicht unterschieden werden können, T1/2 erhöht und Fmob im Vergleich zum führenden Pol im WT verringert (Abb. 6e). Wichtig ist, dass in ΔmglB- und ΔmglC-Zellen T1/2 und Fmob von RomR-mCherry an den beiden Polen ähnlich waren und die T1/2-Werte deutlich niedriger und die Fmob-Werte deutlich höher waren als am nacheilenden Pol im WT (Abb. 6e). .

Diese Beobachtungen belegen, dass MglB und MglC gemeinsam den polaren RomR-mCherry-Umsatz reduzieren und somit belegen, dass eine stabilere polare Bindung von RomR in Gegenwart von MglC und MglB die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB schließt.

Um zu untersuchen, wie MglA-GTP die positive RomR/MglC/MglB-Rückkopplung hemmt, stellten wir die Hypothese auf, dass MglA-GTP die Interaktion zwischen RomR/MglC, MglC/MglB oder beiden unterbricht. Zu diesem Zweck führten wir Pulldown-Experimente mit Strep-MglC als Köder durch. Strep-MglC zog His6-MglB und MalE-RomR herunter, jedoch nicht MglA-His6 in Gegenwart des nicht hydrolysierbaren GTP-Analogons GppNHp oder GDP (Abb. 7a, b; ergänzende Abb. 8a). Interessanterweise zog Strep-MglC in Gegenwart von mit GppNHp beladenem MglA-His6 His6-MglB nicht mehr herunter, in Gegenwart von mit GDP beladenem MglA-His6 jedoch immer noch His6-MglB (Abb. 7a). Im Gegensatz dazu zog Strep-MglC MalE-RomR in Gegenwart von MglA-His6 herunter, das entweder mit GppNHp oder GDP beladen war (Abb. 7b). Wir kommen zu dem Schluss, dass MglA-GTP spezifisch die MglC/MglB-Wechselwirkung unterbricht, nicht jedoch die MglC/RomR-Wechselwirkung. Diese Beobachtung stimmt auch damit überein, dass weder MglC noch RomR/MglC die GAP-Aktivität von MglB und MglB/RomY beeinflussen (ergänzende Abbildung 4). Somit führt die Zugabe von MglA-GTP zum RomR/MglC/MglB-Komplex zur Sequestrierung von MglB durch MglA-GTP, wodurch die MglB-GAP-Aktivität fortgesetzt werden kann.

a, b MglA-GTP unterbricht die Interaktion zwischen MglC und MglB. Pulldown-Experimente wurden mit Strep-MglC als Köder auf dem angegebenen Harz durchgeführt, wie in Abb. 2 beschrieben. MglA-His6 wurde mit GppNHp oder GDP (Endkonzentration 40 µM) vorinkubiert. Alle Puffer enthielten 40 µM GppNHp oder GDP. In a wurden die SDS-PAGE-Gele durch Immunblotting mit α-MglB-Antikörpern untersucht. In b sind die mehreren Banden unterhalb von MalE-RomR Abbauprodukte. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Experimenten erzielt. C. Kristallographische Struktur von MglA-GTPγS:MglB2 (grau/gelb) (pdb-ID: 6izw41), überlagert mit dem AlphaFold-Multimer-Modell eines MglC2:MglB2-Komplexes (braun/rot). Im Einschub ist R115 in jedem der MglB-Protomere im MglA-GTPγS:MglB2-Komplex in Gelb und im MglC2:MglB2-Modell in Rot dargestellt; D26 und I28 sind für eines der MglC-Protomere braun dargestellt. Pfeile zeigen die Neupositionierung von R115 in den beiden Komplexen an. Der Einfachheit halber wird gezeigt, dass das MglC-Dimer nur mit einem MglB-Dimer interagiert. d Schematische Darstellung der Aufhebung der MglB/MglC-Wechselwirkung durch MglA-GTP. Gebogene Pfeile zeigen die Konformationsänderung der MglB-Dimere bei der Bindung von MglA-GTP. e Regulatorische Wechselwirkungen, die die Polarität von vorne nach hinten in M. xanthus herstellen und aufrechterhalten. f Unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen den Polaritätsproteinen dominieren am führenden und nacheilenden Pol im WT und der ΔmglC-Mutante. Volle Pfeile zeigen lokal starke Wechselwirkungen, gestrichelte Pfeile zeigen lokal unterdrückte Wechselwirkungen. Der Pfeil von RomR auf sich selbst zeigt die positive Rückkopplung an, die seine polare Lokalisierung verstärkt, es ist jedoch nicht bekannt, wie RomR polar lokalisiert wird. Farbcode wie in e.

Um die Grundlage für die MglA-GTP-Hemmung der MglC/MglB-Wechselwirkung zu verstehen, haben wir die gelöste Struktur von MglA-GTPɣS:MglB2 mit dem MglC2:(MglB2)2 AlphaFold-Multimer-Modell verglichen (Abb. 6a). Wir identifizierten signifikante Konformationsunterschiede in den MglB-Dimeren in den beiden Komplexen. Insbesondere befindet sich die MglB2-Vierhelixseite bei Komplexierung mit MglA-GTPɣS in einem offeneren Zustand als bei MglC2 (Abb. 7c). Infolgedessen sind die beiden R115-Reste in den MglB-KRK-Regionen wahrscheinlich so im Komplex mit MglA-GTPɣS positioniert, dass sie nicht mit D26 und I28 in der MglC-FDI-Region interagieren können (Abb. 7c, d; siehe auch Abb . 6a). Wir stellen fest, dass in der gelösten Struktur des MglB-Dimers mit MglA-GTPɣS die Vier-Helix-Seite offener ist als in der gelösten Struktur des isolierten MglB-Dimers (ergänzende Abbildung 8b). Somit unterstützen diese gelösten Strukturen zusammen mit dem AlphaFold-Multimer-Modell des MglC2:(MglB2)2-Komplexes, dass das MglB-Dimer in drei verschiedenen Konformationszuständen existieren kann, wobei der Grad der „Offenheit“ auf der Vier-Helix-Seite variiert (Ergänzung). Abb. 8c).

Hier identifizieren wir MglC als eine kritische Komponente des Polaritätsmoduls für die umschaltbare Front-Hinten-Polarität in M. xanthus. Wir zeigen, dass das zuvor vorgeschlagene positive RomR/MglB-Feedback MglC einbezieht und von diesem abhängt. Diese drei Proteine ​​bilden einen heteromeren RomR/MglC/MglB-Komplex, in dem MglC zwischen RomR und MglB eingebettet ist. In vivo stellen sie die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB her, die zur Kolokalisation des RomR/RomX-GEF und der MglB/RomY-Lücke in hohen Konzentrationen am nacheilenden Pol führt (Abb. 7e und f, oberes Feld). Darüber hinaus zeigen wir, dass die zuvor berichtete hemmende Wirkung von MglA-GTP auf das positive RomR/MglB-Feedback darauf zurückzuführen ist, dass MglA-GTP die MglC/MglB-Wechselwirkung unterbricht, ohne die RomR/MglC-Wechselwirkung im RomR/MglC/MglB-Positiv zu beeinträchtigen Feedback (Abb. 7e und f, oberes Feld). Durch diese Hemmwirkung begrenzt MglA-GTP am führenden Pol die Ansammlung der anderen Polaritätsregulatoren an diesem Pol. Durch die Beteiligung an diesen Wechselwirkungen stimuliert MglC die polare Lokalisierung der verbleibenden Polaritätsproteine ​​und ist auch der Schlüssel zur dynamischen Polaritätsumkehr als Reaktion auf die Frz-Signalisierung.

In-vitro-Beobachtungen zusammen mit einem AlphaFold-Multimer-Strukturmodell des MglC/MglB-Komplexes und In-vivo-Experimenten belegen, dass der RomR:MglC:MglB-Komplex in vivo eine Stöchiometrie von 3:2:4 aufweist. Insbesondere belegen unsere Daten, dass der negativ geladene α-helikale RomRC mit den beiden nebeneinanderliegenden positiv geladenen KRR-Oberflächenbereichen im MglC-Dimer interagiert und dass jeder der beiden negativ geladenen FDI-Oberflächenbereiche im MglC-Dimer mit der positiv geladenen KRK-Oberfläche interagiert Regionen in einem MglB-Dimer. Diese Wechselwirkungen zwischen entgegengesetzt geladenen Oberflächenregionen ermöglichen es polarem RomR, MglC zu rekrutieren, was wiederum MglB rekrutiert. FRAP-Experimente in vivo zeigten, dass MglC und MglB eine stabilere polare RomR-Belegung ermöglichen. Basierend auf diesen Erkenntnissen schließen wir, dass die positive Rückmeldung von RomR/MglC/MglB für die Pollokalisierung eine direkte Rekrutierung über die RomR→MglC→MglB-Wechselwirkungen beinhaltet. Diese Wechselwirkungen stabilisieren die polare RomR-Bindung und schließen dadurch die positive Rückkopplung. Da weder RomR, MglC noch RomR/MglC messbare GAP-Aktivität aufweisen oder die GAP-Aktivität von MglB/RomY und MglB messbar beeinflussen, schließen wir, dass eine Funktion von MglC darin besteht, MglB und RomR zu verbinden, um das positive Feedback herzustellen.

In vitro unterbricht MglA-GTP die MglC/MglB-Wechselwirkung im RomR/MglC/MglB-Komplex, ohne die RomR/MglC-Wechselwirkung zu beeinträchtigen. Ein Vergleich der gelösten Struktur des MglA-GTPγS:MglB2-Komplexes mit einem AlphaFold-Multimer-Modell des MglC2:(MglB2)2-Komplexes bestätigt, dass MglA-GTP die MglC/MglB-Wechselwirkung mithilfe eines allosterischen Mechanismus unterbricht. In diesem Modell induziert MglA-GTP durch Bindung an die Zwei-Helix-Seite eines MglB-Dimers eine Konformationsänderung, die die Vier-Helix-Seite des MglB-Dimers verändert und dadurch die Wechselwirkung zwischen den MglC-FDI- und MglB-KRK-Schnittstellen unterbricht. Diese Beobachtungen werden dadurch gestützt, dass RomR/MglC weder die MglB- noch die MglB/RomY-GAP-Aktivität beeinflusst (ergänzende Abbildung 4). Somit besteht die zweite Funktion von MglC darin, die hemmende Wirkung von MglA-GTP auf die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB in vivo zu ermöglichen. In unserem Modell hemmt die hohe Konzentration des MglB/RomY-GAP-Komplexes am nacheilenden Pol die Rekrutierung von MglA-GTP an diesem Pol durch Stimulierung der MglA-GTPase-Aktivität. In diesem Prozess unterbricht MglA-GTP die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB, was zur Ablösung von MglB führt. Aufgrund der hohen Konzentration von RomR und MglC an diesem Pol wird MglB jedoch schnell wieder eingefangen, um den RomR/MglC/MglB-Komplex wiederherzustellen. In Übereinstimmung mit dieser Annahme tauscht polares MglB in FRAP-Experimenten schnell mit dem Zytoplasma mit einer T1/2 von ~6 Sekunden aus34.

Unsere Studie wirft mehrere interessante Fragen für zukünftige Forschungen zu den Proteinen des Polaritätsmoduls auf. Erstens hat RomRC drei Funktionen: Es interagiert nicht nur mit MglC, sondern vermittelt auch die Oligomerisierung mit Dimer- und Trimerbildung und ist für die polare Lokalisierung von RomR erforderlich und zumindest teilweise verantwortlich. Die In-vivo-Quantifizierung der RomR-Konzentration (ergänzende Abbildung 5e) legt nahe, dass trimeres RomR in vivo die vorherrschende Form ist. Welche der beiden Formen die aktive Form darstellt, muss jedoch noch bestimmt werden. Ebenso ist nicht bekannt, wie RomRC die polare Lokalisierung von RomR herbeiführt und wie RomR seine polare Bindung stimuliert. Zweitens belegen experimentelle Beweise und AlphaFold-Multimer-Strukturmodelle, dass MglB sein Co-GAP-RomY mit geringer Affinität auf der Zwei-Helix-Seite bindet. Wir schlagen daher vor, dass der RomR/MglC/MglB-Komplex am nacheilenden Pol auch RomY enthält und einen RomR/MglC/MglB/RomY-Komplex bildet. Drittens interagiert RomR mit RomX, um den polar lokalisierten Rom/RomX-GEF-Komplex zu erzeugen. Obwohl die Strukturdetails dieses Komplexes unbekannt sind, lassen sie die Möglichkeit aufkommen, dass der RomR/MglC/MglB-Komplex auch RomX enthalten könnte. Die gebildeten Komplexe werden in zukünftigen Arbeiten behandelt.

Die ΔmglC-Mutante ähnelt WT in Bezug auf die unidirektionale Motilität, ist jedoch weniger empfindlich gegenüber Frz-Signalen, was dafür spricht, dass die letztendliche Funktion von MglC darin besteht, eine Empfindlichkeit gegenüber Frz-Signalen herzustellen und dadurch Polaritätsumkehrungen zu ermöglichen. Die beiden Ausgangsreaktionsregler des Frz-Systems, FrzX und FrzZ, wirken über unbekannte Mechanismen auf das Polaritätsmodul, um Polaritätsumkehrungen zu ermöglichen30,31,33,34. Die Beobachtung, dass der ΔmglC-Mutant immer noch auf ein hohes Maß an Frz-Signalisierung reagiert, legt nahe, dass MglC nicht das nachgeschaltete molekulare Ziel des Frz-Systems ist, sondern die Frz-Reaktionsfähigkeit durch einen anderen Mechanismus ermöglicht. Wie vom Modell für die Polaritätsfestlegung vorhergesagt (Abb. 7e, f, obere Felder), ist weder MglC noch die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB für die MglA-Lokalisierung am führenden Pol wichtig. Stattdessen kolokalisiert in Abwesenheit von MglC und damit der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB die höchste polare Konzentration des RomR/RomX-Komplexes mit MglA am führenden Pol (Abb. 7f, unteres Feld). In der ΔmglC-Mutante wird die polare Lokalisierung von RomR/RomX und MglA dadurch gesteuert, dass RomR seine eigene polare Bindung in einem positiven Feedback stimuliert und dann RomX und MglA rekrutiert (Abb. 7f, unteres Feld). Somit reagiert das Polaritätsmodul in dieser Konfiguration weniger empfindlich auf das Frz-System, während die Vorne-Hinten-Polarität robust beibehalten wird. Basierend auf theoretischen Argumenten haben wir zuvor argumentiert, dass die Konfiguration mit einer hohen Konzentration des RomR/RomX-GEF am nacheilenden Pol die schnelle Akkumulation von MglA-GTP an diesem Pol als Reaktion auf die Frz-Signalisierung ermöglichen würde, was die Umkehrung der Polarität ermöglichen würde. Wir schlagen daher vor, dass die räumliche Konfiguration der Polaritätsproteine ​​in der ΔmglC-Mutante sie weniger empfindlich gegenüber Frz-Signalen macht, da am nacheilenden Pol zu wenig RomR/RomX-GEF vorhanden ist, um MglA-GTP während Umkehrungen zu rekrutieren. Somit dient die positive Rückkopplung von RomR/MglC/MglB, die zur eigentümlichen Kolokalisierung des RomR/RomX-GEF und der MglB/RomY-Lücke am nacheilenden Pol im WT führt, zwei Zwecken: Erstens verdrängt die GAP-Aktivität MglA-GTP von diesem Pol, um die Aktivierung zu ermöglichen unidirektionale Translokation; und zweitens ist die GEF-Aktivität notwendig, um dem System die Fähigkeit zu verleihen, die Polarität schnell und effizient umzukehren. Mit anderen Worten besteht eine wichtige Funktion von MglC und der positiven Rückkopplung von RomR/MglC/MglB darin, die Konfiguration der Polaritätsproteine ​​festzulegen, die dem Polaritätsmodul eine Reaktionsfähigkeit auf das Frz-System verleihen. Um auf die in der Einleitung aufgeworfene Frage zurückzukommen, nämlich warum in verschiedenen polaritätsregulierenden Netzwerken unterschiedliche Netzwerkdesigns mit funktional äquivalenten Ergebnissen ausgewählt wurden, konzentriert sich das positive Feedback im S. cerevisiae-Polaritätssystem, das den einzelnen Cdc42-Cluster bildet, auf Cdc42 und der Cdc24 GEF9. Daher bleibt diese Polarität stabil erhalten, sobald der Cdc42-Cluster etabliert ist, und der Zerfall einer entstehenden Knospenstelle oder die Bildung konkurrierender Knospenstellen wird wirksam vermieden. In der ΔmglC-Mutante führt RomR durch die Stimulierung seiner eigenen polaren Bindung in einer positiven Rückkopplung zu einer polaren Lokalisierung von RomR/RomX und MglA am gleichen Pol (Abb. 7f, unteres Feld). Dieses Design ähnelt konzeptionell dem Hefesystem, das die Bildung von Cdc42-Clustern antreibt. Während die Netzwerkdesigns der M. xanthus- und S. cerevisiae-Polaritätssysteme die Bildung eines einzelnen MglA/Cdc42-Clusters ermöglichen, können die unterschiedlichen Verkabelungen so rationalisiert werden, dass das M. xanthus-Polaritätsmodul Teil eines räumlichen Kippschalters ist ist optimal für stabile Polarität sowie für schnelle Polaritätsumkehrungen. Im Gegensatz dazu ist das S. cerevisiae-System darauf optimiert, eine stabile Polarität zu gewährleisten.

Im Prinzip scheint es, dass das positive Feedback von RomR/MglC/MglB durch die direkte Interaktion von RomR mit MglB hätte hergestellt werden können, was die Frage nach dem Vorteil der Einbindung von MglC in das positive Feedback von RomR/MglC/MglB aufwirft. Die Familie der Roadblock-Domänenproteine ​​ist uralt, in allen Lebensbereichen reichlich vorhanden und oft an der Regulierung der GTPase-Aktivität beteiligt37,46,47,48. Interessanterweise bestehen die Rag-GTPasen des mTOR-Signalwegs aus einer kleinen GTPase-Domäne und einer C-terminalen Roadblock-Domäne und bilden mithilfe ihrer Roadblock-Domänen Heterodimere. Diese Heterodimere werden durch den Ragulator-Komplex zu Lysosomen rekrutiert, der zwei Roadblock-Heterodimere enthält, die Kopf-an-Schwanz interagieren und einen tetrameren Komplex bilden. Die Rag-GTPase/Ragulator-Wechselwirkung erfolgt über die Roadblock-Domänen, was zu drei Schichten heterodimerer Roadblock-Domänen führt49. Interessanterweise reguliert der GTP/GDP-Zustand von Rag-Heterodimeren allosterisch ihre Bindung an Ragulator, indem er die Wechselwirkung zwischen Paaren von Roadblock-Heterodimeren abstimmt50,51. Dieser Mechanismus ähnelt konzeptionell bemerkenswert dem GTP/GDP-Zustand von MglA, der die Wechselwirkung zwischen den MglC/MglB-Homodimeren reguliert, was dafür spricht, dass dieser Regulierungsmechanismus evolutionär konserviert ist. Wir vermuten, dass das Vorhandensein von MglC im positiven Feedback von RomR/MglC/MglB einen alten Regulierungsmechanismus widerspiegelt, bei dem der GTP/GDP-Zustand einer Partner-GTPase die Wechselwirkung zwischen Paaren von Roadblock-Dimeren modulieren kann.

Die in dieser Arbeit verwendeten Stämme, Plasmide und Primer sind in den Ergänzungstabellen 1, 2 und 3 aufgeführt. Alle M. xanthus-Stämme sind Derivate des Stammes DK1622 WT52. M. xanthus wurde bei 32 °C in 1 % CTT-Brühe53 oder auf 1,5 % Agar, ergänzt mit 1 % CTT und Kanamycin (50 µg mL-1) oder Oxytetracyclin (10 µg mL-1), je nach Bedarf, gezüchtet. In-Frame-Löschungen wurden wie beschrieben generiert54. Plasmide wurden durch Elektroporation in M. xanthus eingeführt und durch homologe Rekombination am endogenen Locus oder am mxan18-19-Locus oder durch ortsspezifische Rekombination an der Mx8 attB-Stelle integriert. Alle In-Frame-Deletionen und Plasmidintegrationen wurden durch PCR verifiziert. Plasmide wurden in Escherichia coli TOP10 vermehrt (F-, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7679, galU, galK, rpsL, endA1, nupG) . E. coli wurde in LB oder auf Platten mit LB, ergänzt mit 1,5 % Agar, bei 37 °C und gegebenenfalls mit Antibiotikazusatz gezüchtet55. Alle durch PCR erzeugten DNA-Fragmente wurden durch Sequenzierung verifiziert.

Populationsbasierte Motilitätstests wurden wie beschrieben durchgeführt56. Kurz gesagt, M. xanthus-Zellen aus exponentiell wachsenden Kulturen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 4000 × g geerntet und in 1 % CTT auf eine berechnete Dichte von 7 × 109 Zellen ml-1 resuspendiert. 5-µL-Aliquots der Zellsuspensionen wurden auf 0,5 %-Agarplatten, ergänzt mit 0,5 % CTT für T4P-abhängige Motilität, und 1,5 %-Agarplatten, ergänzt mit 0,5 % CTT für gleitende Motilität, gegeben und bei 32 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Kolonieränder mit einem Leica M205FA-Stereomikroskop sichtbar gemacht und mit einer Hamamatsu ORCA-flash V2 Digital CMOS-Kamera (Hamamatsu Photonics) unter Verwendung der LASX-Software (Leica Microsystems) abgebildet. Für stärkere Vergrößerungen von Zellen an Kolonierändern auf 1,5 % Agar wurden die Zellen mit einem Leica DMi8-Umkehrmikroskop sichtbar gemacht und mit einer Leica DFC9000 GT-Kamera abgebildet.

Einzelne Zellen wurden wie beschrieben verfolgt29. Kurz gesagt, für die T4P-abhängige Motilität wurden 5 µL exponentiell wachsender Kulturen in eine Polystyrolplatte mit 24 Vertiefungen (Falcon) getupft. Nach 10 Minuten bei RT wurden die Zellen mit 500 µL 1 % Methylcellulose in MMC-Puffer (10 mM MOPS (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure) pH 7,6, 4 mM MgSO4, 2 mM CaCl2) bedeckt und bei RT inkubiert 30 Minuten. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang in 20-Sekunden-Intervallen bei RT mit einem Leica DMi8-Umkehrmikroskop und einer Leica DFC9000 GT-Kamera sowie der LASX-Software (Leica Microsystems) sichtbar gemacht. Einzelne Zellen wurden mit Metamorph 7.5 (Molecular Devices) und ImageJ 1.52 verfolgt b57 und dann die Geschwindigkeit einzelner Zellen pro 20-Sekunden-Intervall sowie die Anzahl der Umkehrungen pro Zelle pro 10 Minuten berechnet. Zum Gleiten wurden 5 µL exponentiell wachsender Kulturen auf 1,5 % Agarplatten, ergänzt mit 0,5 % CTT, gegeben, mit einem Deckobjektträger abgedeckt und bei 32 °C inkubiert. Nach 4 bis 6 Stunden wurden die Zellen wie beschrieben 15 Minuten lang in 30-Sekunden-Intervallen bei RT beobachtet, wobei die Geschwindigkeit pro 30-Sekunden-Intervall sowie die Anzahl der Umkehrungen pro 15 Minuten berechnet wurden.

Die Immunblot-Analyse wurde wie beschrieben durchgeführt55. Polyklonales Kaninchen-α-MglA27 (Verdünnung 1:5000), α-MglB27 (Verdünnung 1:5000), α-RomR32 (1:5000), α-PilC58 (Verdünnung 1:5000), α-PilO59 (Verdünnung 1:2000) , α-PilT60 (Verdünnung 1:2000), α-mCherry (Biovision, Verdünnung 1:15000) und α-MglC-Antikörper (Verdünnung 1:5000) wurden zusammen mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (Sigma) verwendet. als sekundärer Antikörper (Verdünnung 1:10000). Maus-Antikörper α-GFP (Sigma, Verdünnung 1:2000) und α-EF-Tu (HycultBiotech, Verdünnung 1:5000) wurden zusammen mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin G (GE Healthcare) als sekundärer Antikörper (Verdünnung) verwendet 1:2000). Um polyklonale Kaninchen-α-MglC-Antikörper zu erzeugen, wurde His6-MglC wie beschrieben gereinigt (siehe unten) und wie beschrieben für die Immunisierung verwendet55. Blots wurden mit Luminata Crescendo Western HRP-Substrat (Millipore) entwickelt und mit einem LAS-4000 Lumineszenzbildanalysator (Fujifilm) visualisiert. Die Proteine ​​wurden wie beschrieben durch SDS-PAGE aufgetrennt55.

Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden exponentiell wachsende Zellen auf Objektträger gelegt, die ein dünnes Kissen aus 1 % SeaKem LE-Agarose (Cambrex) mit TPM-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mM MgSO4) und 0,2 % CTT enthielten und mit einem Deckglas abgedeckt. Nach 30 Minuten bei 32 °C wurden die Zellen mit einem temperaturgesteuerten Leica DMi8-Umkehrmikroskop sichtbar gemacht und Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder mit einer Hamamatsu ORCA-flash V2 Digital CMOS-Kamera und der LASX-Software (Leica Microsystems) aufgenommen. Für Zeitrafferaufnahmen wurden Zellen 15 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen abgebildet. Um die Expression von Genen aus dem Vanillate-induzierbaren Promotor61 zu induzieren, wurden die Zellen wie beschrieben in Gegenwart von 300 μM Vanillate behandelt und 6 Stunden lang abgebildet. Um die Lokalisierung fluoreszierend markierter Proteine ​​präzise zu quantifizieren, verwendeten wir eine etablierte Analysepipeline17, bei der die Ausgabe für jede Zelle die gesamte zelluläre Fluoreszenz, die gesamte Fluoreszenz in Clustern an jedem Pol und die mittleren Fluoreszenzanteile an jedem der beiden Pole ist. Datenpunkte für einzelne Zellen wurden in Streudiagrammen dargestellt, in denen die Pole mit dem höchsten und niedrigsten polaren Fluoreszenzanteil als Pol 1 bzw. Pol 2 definiert sind. Die Streuung der Einzelzellmessungen wird berechnet und durch Fehlerbalken und Ellipsen dargestellt, wobei die Richtung und Länge der Fehlerbalken durch die Eigenvektoren und die Quadratwurzel der entsprechenden Eigenwerte der Polarbruch-Kovarianzmatrix für jede Belastung definiert werden. Zur Berechnung des mittleren Fluoreszenzanteils an den Polen wurden Zellen mit und ohne Cluster einbezogen. Die Quantifizierung der Fluoreszenzsignale ist in der Ergänzungstabelle 4 enthalten.

Mikroskopbilder wurden mit Fiji62 verarbeitet und Zellmasken mit Oufti63 bestimmt und bei Bedarf manuell korrigiert. Die Fluoreszenz wurde in Matlab R2020a (The MathWorks) wie beschrieben quantifiziert17.

FRAP-Experimente wurden wie beschrieben64 mit einem temperaturgesteuerten Nikon Ti-E-Mikroskop mit Perfect Focus System und einem CFI PL APO 100x/1,45 Lambda-Ölobjektiv bei 32 °C mit einer Hamamatsu Orca Flash 4.0-Kamera unter Verwendung der NIS Elements AR 2.30-Software (Nikon) durchgeführt ) im Dunkeln. Das Photobleichen wurde unter Verwendung eines einzelnen kreisförmigen Bereichs mit 20 % Laserleistung (561 nm) und einer Verweilzeit von 500 µs durchgeführt. Für jedes Bild wurden integrierte Fluoreszenzintensitäten einer gesamten Zelle und der gebleichten Region of Interest (ROI) gemessen. Nach der Hintergrundkorrektur wurde die korrigierte Fluoreszenzintensität des gebleichten ROI durch die gesamte korrigierte Zellfluoreszenz dividiert, wobei Bleicheffekte während der Bildaufnahme korrigiert wurden. Die Zellsegmentierung und Hintergrundkorrektur wurde mit Oufti durchgeführt. Diese normalisierte Fluoreszenz wurde mit der anfänglichen Fluoreszenz im ROI korreliert. Die mittlere relative Fluoreszenz der Zellen wurde als Funktion der Zeit aufgetragen. Die Wiederfindungsrate für ein bestimmtes fluoreszierendes Protein wurde bestimmt, indem die aufgezeichneten Daten mit Matlab R2020a (The MathWorks) an eine einzelne Exponentialgleichung angepasst wurden.

Alle Proteine ​​wurden in E. coli Rosetta 2(DE3) (F− ompT hsdSB (rB − mB −) gal dcm (DE3 pRARE2) bei 18 °C oder 37 °C exprimiert. Zur Reinigung His6-markierter Proteine ​​wurde die Ni-NTA-Affinität verwendet Reinigung wurde verwendet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 5 % Glycerin, 5 mM MgCl2) gewaschen und in Lysepuffer A (50 ml Waschpuffer A) resuspendiert ergänzt mit 1 mM DTT, 100 µg ml-1 Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 U ml-1 DNase 1 und Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche). Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt (48.000 × g, 4 °C, 30 Min.) und Filtration durch einen 0,45-µm-Filter (Sarsted). Das geklärte Zelllysat wurde auf eine 5 ml HiTrap Chelating HP-Säule (Cytiva) geladen, die wie vom Hersteller beschrieben mit NiSO4 vorbeladen und in Puffer A voräquilibriert war Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina Säulenwaschpuffer (Puffer A mit 20 mM Imidazol) gewaschen. Proteine ​​wurden mit Elutionspuffer (Puffer A mit 500 mM Imidazol) unter Verwendung eines linearen Imidazolgradienten von 20 bis 500 mM eluiert. Fraktionen, die gereinigte His6-markierte Proteine ​​enthielten, wurden kombiniert und auf eine HiLoad 16/600 Superdex 75 pg (GE Healthcare) Gelfiltrationssäule geladen, die mit Puffer 1 (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 5 % Glycerin). Fraktionen, die His6-markierte Proteine ​​enthielten, wurden gepoolt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Zur Reinigung von MalE-markierten Proteinen (MalE-RomR, MalR-RomR1–368, MalR-RomRC und MalE-MglC) wurde die Affinitätsreinigung des Maltose-bindenden Proteins (MBP) verwendet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in Puffer B (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) gewaschen und in 50 ml Lysepuffer B (50 ml Puffer B, ergänzt mit 100 µg mL-1 PMSF) resuspendiert , DNase 1 10U mL−1 und Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche)). Die Zellen wurden lysiert und die Zelllysate wie beschrieben hergestellt und auf eine 5 ml MBPTrapHP (Cytiva)-Säule geladen, die mit Puffer B äquilibriert war. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina Puffer B gewaschen. Proteine ​​wurden mit Elutionspuffer B (Puffer B mit 10) eluiert mM Maltose). Eluierte Fraktionen, die das relevante MalE-markierte Protein enthielten, wurden auf eine 5-ml-HiTrap-Q-HP-Ionenaustauschsäule (Cytiva) geladen, die mit Puffer C (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5 mM) äquilibriert war % Glycerin). Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina Puffer C gewaschen. Die Mal-markierten Proteine ​​wurden mit Puffer C unter Verwendung eines linearen NaCl-Gradienten von 50 bis 500 mM eluiert. Fraktionen, die die mit MalE markierten Proteine ​​enthielten, wurden auf eine Gelfiltrationssäule vom Typ HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare) geladen, die mit Puffer 1 äquilibriert war. Fraktionen mit mit MalE markierten Proteinen wurden gepoolt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert °C.

Zur Reinigung von Strep-markierten Proteinen wurde die Biotin-Affinitätsreinigung verwendet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in Puffer C (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) gewaschen und in Lysepuffer C (50 ml Waschpuffer C, ergänzt mit 100 µg mL-1 PMSF) resuspendiert , 10U mL−1 DNase 1 und Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche). Die Zellen wurden lysiert und das gereinigte Lysat wurde wie beschrieben hergestellt und auf eine 5-ml-Strep-Trap-HP-Säule (Cytiva) geladen, die mit Puffer C äquilibriert war. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina Puffer C gewaschen. Das Protein wurde mit Elutionspuffer C (Puffer C) eluiert mit 2,5 mM Desthiobiotin). Elutionsfraktionen, die Strep-markierte Proteine ​​enthielten, wurden auf eine HiLoad 16/600 Superdex 75 pg (GE Healthcare)-Gelfiltrationssäule geladen, die mit Puffer 1 äquilibriert war. Fraktionen mit Strep-markierten Proteinen wurden gepoolt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert °C.

Um Wechselwirkungen mit MglA-, MglB- und RomR-Varianten zu testen, wurde Strep-MglC (Endkonzentration 10 µM) mit MglA-His6, His6-MglB, MalE-RomR, MalE-RomR1–368 oder MalE-RomRC (Endkonzentration 10 µM) inkubiert ) in Puffer 1 (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 5 % Glycerin) für 30 min bei RT. Anschließend wurden 10 µL Strep-Tactin MagStrep' Typ3' XT-Kügelchen (IBA Lifesciences), die zuvor mit Puffer 1 äquilibriert wurden, 30 Minuten lang bei RT zugegeben. Anschließend wurden die Perlen 10 Mal mit 1 ml Puffer 1 gewaschen. Die Proteine ​​wurden mit 200 µL Elutionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Biotin) eluiert. Um Wechselwirkungen mit MglC, MglA und MglB zu testen, wurde MalE-RomR (Endkonzentration 10 µM) mit Strep-MglC, MglA-His6 und/oder His6-MglB (Endkonzentration 10 µM) in Puffer 1 für 30 Minuten bei RT inkubiert . Anschließend wurde die Mischung zu 200 µL Amyloseharz gegeben, das zuvor mit Puffer 1 äquilibriert worden war, und 30 Minuten bei RT inkubiert. Das Harz wurde dann 10 Mal mit 1 ml Puffer 1 gewaschen. Proteine ​​wurden mit 200 µL Elutionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Amylose) eluiert. Um Wechselwirkungen mit MglC, MglA und RomR zu testen, wurde His6-MglB (Endkonzentration 10 µM) mit Strep-MglC, MglA-His6 und/oder MalE-RomR (Endkonzentration 10 µM) in Puffer 1 für 30 Minuten bei RT inkubiert . Anschließend wurden 20 µL Amintra Nickel Magnetic Beads (Expedeon), die zuvor mit Puffer 1 äquilibriert worden waren, zu der Mischung gegeben und 30 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Perlen 10 Mal mit 1 ml Puffer 2 (Puffer 1 mit 50 mM Imidazol) gewaschen. Proteine ​​wurden mit 200 µL Elutionspuffer (Puffer 1 mit 500 mM Imidazol) eluiert. In Experimenten mit MglA-His6 wurde MglA-His6 (Endkonzentration 10 µM) 30 Minuten lang bei RT in Puffer 1 mit GTP, GDP oder GppNHp (Endkonzentration 40 µM) vorbeladen und alle Puffer enthielten 40 µM des relevanten Nukleotids.

Die GTP-Hydrolyse durch MglA-His6 wurde mithilfe eines kontinuierlichen, regenerativ gekoppelten GTPase-Assays65 in Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 % Glycerin, 1 mM DTT, 7,5 mM MgCl2), ergänzt mit 495 µM NADH, gemessen (Sigma), 2 mM Phosphoenolpyruvat (Sigma), 18–30 U mL-1 Pyruvatkinase (Sigma) und 27–42 U mL-1 Lactatdehydrogenase (Sigma). Für alle Tests wurde MglA-His6 (Endkonzentration 2 µM) 30 Minuten lang bei RT in Reaktionspuffer mit GTP (Endkonzentration 3,3 mM) vorbeladen. Parallel dazu wurde MglB mit Strep-MglC, MalE-RomR und/oder Strep-RomY für 10 Minuten bei RT in Reaktionspuffer vorinkubiert. GTPase-Reaktionen wurden in 96-Well-Platten (Greiner Bio-One) durchgeführt und durch Zugabe von His6-MglB, Strep-MglC, MalE-RomR und/oder Strep-RomY zum MglA/GTP-Gemisch initiiert. Endkonzentration, MglA-His6: 2 µM, His6-MglB: 4 µM, Strep-MglC: 4 µM, MalE-RomR: 2 µM, Strep-RomY: 2 µM, GTP: 1 mM. Die Absorption wurde bei 340 nm 60 Minuten lang bei 37 °C mit einem Infinite M200 Pro-Plattenlesegerät (Tecan) gemessen und die Menge an hydrolysiertem GTP pro Stunde und Molekül MglA-His6 berechnet. Für jede Reaktion wurde die vom Hintergrund abgezogene GTPase-Aktivität als Mittelwert von drei technischen Replikaten berechnet.

Um die Löslichkeit von MglC-mVenus zu testen, wurden MglCFDI-mVenus und MglCKRR-mVenus in M. xanthus-Zellen in Fraktionen fraktioniert, die mit löslichen und unlöslichen Proteinen angereichert waren, einschließlich Innenmembran- und Außenmembranproteinen, wie beschrieben66. Kurz gesagt, exponentiell wachsende Kulturen wurden mit 11.000 g für 10 Minuten bei RT geerntet und das Zellpellet in Lysepuffer D (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, ergänzt mit Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche)) resuspendiert )). Die Zellen wurden mittels Ultraschall lysiert und die Lysate durch 5-minütige Zentrifugation bei 8000 g und RT geklärt. Das geklärte Lysat wurde einer Ultrazentrifugation mit einem Air-Fuge (Beckman) bei ~150.000 g für 1 Stunde unterzogen. Das resultierende Pellet enthält unlösliche Proteine ​​und wurde vom Überstand, der lösliche Proteine ​​enthält, abgetrennt und in Lysepuffer D resuspendiert. Beide Fraktionen wurden mit SDS-Lysepuffer gemischt und mittels SDS-PAGE und Immunoblot analysiert. Als Kontrolle für ein Protein, das Einschlusskörperchen bildet, wurde in E. coli exprimiertes His6-PilT60 verwendet. EF-Tu wurde als Kontrolle für ein lösliches E. coli-Protein verwendet. E. coli-Zellen wurden wie M. xanthus-Zellen behandelt.

MP wurde mit einem TwoMP-Massenphotometer (Refeyn Ltd, Oxford, UK) durchgeführt. Die Datenerfassung wurde mit AcquireMP (Refeyn Ltd. v2.3) durchgeführt. MP-Filme wurden mit 1 kHz aufgenommen, wobei die Belichtungszeiten zwischen 0,6 und 0,9 ms variierten und so angepasst wurden, dass die Anzahl der Kameras maximiert und gleichzeitig eine Sättigung vermieden wurde. Objektträger (1,5 H, 24×50 mm, Carl Roth) und wiederverwendbare CultureWellTM-Dichtungen wurden mit drei aufeinanderfolgenden Spülschritten mit doppelt destilliertem H2O und 100 % Isopropanol gereinigt und unter einem Druckluftstrom getrocknet. Für die Messungen wurden Dichtungen auf Deckgläser montiert und mit Immersionsöl auf den Tisch des Massenphotometers gelegt. Zusammengesetzte Deckgläser wurden mit Magneten an Ort und Stelle gehalten. Für Messungen wurden die Dichtungsmulden mit 10 µL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) gefüllt, um eine Fokussierung der Glasoberfläche zu ermöglichen. Nach der Fokussierung wurden 10 µL Probe hinzugefügt, schnell gemischt, während die Fokusposition stabil gehalten wurde, und die Messungen begannen. MP-Kontrastwerte wurden unter Verwendung eines hauseigenen Standards auf Molekülmassen kalibriert. Für jede Probe wurden drei separate Messungen durchgeführt. Die Daten wurden mit der DiscoverMP-Software (Refeyn Ltd, v. 2022 R1) analysiert. Die MP-Bildanalyse wurde wie beschrieben durchgeführt67.

Die Strukturvorhersage des AlphaFold-Multimers (Version 2.3.1) wurde mit der ColabFold-Pipeline43,44,45 durchgeführt. ColabFold wurde mit Standardeinstellungen ausgeführt, bei denen mehrere Sequenz-Alignments mit MMseqs268 und HHsearch69 generiert wurden. Die ColabFold-Pipeline generiert fünf Modellränge. Für jeden Rang wurden mit einem benutzerdefinierten Matlab R2020a-Skript (The MathWorks) Diagramme zum vorhergesagten lokalen Distanzdifferenztest (pLDDT) und zum Ausrichtungsfehler (pAE) erstellt. Die Einstufung der Modelle erfolgte auf der Grundlage kombinierter pLDDT- und pAE-Werte, wobei die am besten bewerteten Modelle für die weitere Analyse und Präsentation verwendet wurden. Die Genauigkeit des Pro-Residuen-Modells wurde basierend auf pLDDT-Werten geschätzt (>90, hohe Genauigkeit; 70–90, im Allgemeinen gute Genauigkeit; 50–70, niedrige Genauigkeit; <50, sollte nicht interpretiert werden)45. Relative Domänenpositionen wurden durch pAE45 validiert. Für die weitere Untersuchung wurden nur Modelle mit der höchsten Zuverlässigkeit verwendet, die auf kombinierten pLDDT- und pAE-Werten basierten. Für alle Modelle wurden Sequenzen von Proteinen voller Länge verwendet.

Sequenz-Alignments wurden mit ClustalOmega70 mit Standardparametern generiert und Alignments mit Jalview71 visualisiert. Proteindomänen wurden mit Interpro72 identifiziert. Der Ladungswert wurde mit dem Protein-Sol-Tool73 berechnet. Strukturelle Ausrichtungen und Berechnung des elektrostatischen Oberflächenpotentials wurden in Pymol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrödinger, LLC) durchgeführt.

Die Statistiken wurden mithilfe eines zweiseitigen Student-t-Tests für Stichproben mit ungleichen Varianzen durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie erwähnten Strukturdaten sind in der Protein Data Bank-Datenbank unter den Zugangscodes 6HJM (MglB), 7CY1 (MglC) und 6IZW (MglA gebunden an GTP-ɣ-S und MglB) verfügbar. Die Autoren erklären, dass alle Daten, die diese Studie unterstützen, im Artikel, in der Zusatzinformationsdatei oder in der Quelldatendatei verfügbar sind. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Benutzerdefinierte MATLAB-Skripte zur Analyse von Fluoreszenzdaten und FRAP-Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Treuner-Lange, A. & Søgaard-Andersen, L. Regulierung der Zellpolarität in Bakterien. J. Cell Biol. Rev. 206, 7–17 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rafelski, S. & Marshall, W. Aufbau der Zelle: Designprinzipien der Zellarchitektur. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 9, 593–602 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Surovtsev, IV & Jacobs-Wagner, C. Subzelluläre Organisation: Ein entscheidendes Merkmal der Replikation bakterieller Zellen. Zelle 172, 1271–1293 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Halatek, J., Brauns, F. & Frey, E. Selbstorganisationsprinzipien der intrazellulären Musterbildung. Philos. Trans. R. Soc. London. B Biol. Wissenschaft. 373, 20170107 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chau, AH, Walter, JM, Gerardin, J., Tang, C. & Lim, WA Entwerfen synthetischer regulatorischer Netzwerke, die zur Selbstorganisation der Zellpolarisation fähig sind. Zelle 151, 320–332 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ridley, AJ et al. Zellmigration: Integration von Signalen von vorne nach hinten. Wissenschaft 302, 1704–1709 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Buckley, CE & St Johnston, D. Apikal-basale Polarität und die Kontrolle der Epithelform und -funktion. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 23, 559–577 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gerland, U. & Hwa, T. Evolutionäre Selektion zwischen alternativen Arten der Genregulation. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 106, 8841–8846 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chiou, J.-G., Balasubramanian, MK & Lew, DJ Zellpolarität in Hefe. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 33, 77–101 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Etienne-Manneville, S. & Hall, A. Rho GTPasen in der Zellbiologie. Natur 420, 629–635 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schumacher, D. & Søgaard-Andersen, L. Regulierung der Zellpolarität bei Motilität und Zellteilung in Myxococcus xanthus. Annu. Rev. Microbiol. 71, 61–78 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seetharaman, S. & Etienne-Manneville, S. Zytoskelett-Crosstalk bei der Zellmigration. Trends Zellbiol. 30, 720–735 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wittinghofer, A. & Vetter, IR Struktur-Funktions-Beziehungen der G-Domäne, ein kanonisches Schaltermotiv. Ann. Rev. Biochem. 80, 943–971 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cherfils, J. & Zeghouf, M. Regulierung kleiner GTPasen durch GEFs, GAPs und GDIs. Physiol. Rev. 93, 269–309 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, C.-F. & Lew, DJ Jenseits der Symmetriebrechung: Konkurrenz und negatives Feedback bei der GTPase-Regulierung. Trends Zellbiol. 23, 476–483 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, SG Spontane Zellpolarisation: Die Rückkopplungskontrolle der Cdc42-GTPase bricht die Zellsymmetrie. BioEssays 37, 1193–1201 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carreira, LAM, Tostevin, F., Gerland, U. & Søgaard-Andersen, L. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk, das den Aufbau und die Aufrechterhaltung einer umschaltbaren Zellpolarität steuert. PLUS Genet. 16, e1008877 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y., Ducret, A., Shaevitz, J. & Mignot, T. Von der individuellen Zellmotilität zum kollektiven Verhalten: Erkenntnisse von einem Prokaryoten, Myxococcus xanthus. FEMS Mikrobiol. Rev. 36, 149–164 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carreira, LAM, Szadkowski, D., Müller, F. & Søgaard-Andersen, L. Spatiotemporale Regulierung des Wechsels der Polarität von Vorder- und Hinterzellen. Curr. Meinung. Zellbiol. Rev. 76, 102076 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blackhart, BD & Zusman, DR „Frizzy“-Gene von Myxococcus xanthus sind an der Kontrolle der Häufigkeit der Umkehrung der Gleitmotilität beteiligt. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 82, 8771–8774 (1985).

Artikel Google Scholar

Sun, H., Zusman, DR & Shi, W. Typ IV-Pilus von Myxococcus xanthus ist ein Motilitätsapparat, der durch das chemosensorische frz-System gesteuert wird. Curr. Biol. 10, 1143–1146 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mignot, T., Shaevitz, JW, Hartzell, PL & Zusman, DR Beweise dafür, dass fokale Adhäsionskomplexe die Gleitmotilität von Bakterien fördern. Wissenschaft 315, 853–856 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mercier, R. et al. Die polare Ras-ähnliche GTPase MglA aktiviert den Pilus Typ IV über SgmX, um die Zuckungsmotilität in Myxococcus xanthus zu ermöglichen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 117, 28366–28373 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Potapova, A., Carreira, LAM & Søgaard-Andersen, L. Die kleine GTPase MglA stimuliert zusammen mit dem TPR-Domänenprotein SgmX die Pili-Bildung vom Typ IV in M. xanthus. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 117, 23859–23868 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Treuner-Lange, T. et al. Das kleine G-Protein MglA verbindet sich an bakteriellen fokalen Adhäsionen mit dem MreB-Aktin-Zytoskelett. J. Cell Biol. 210, 243–256 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y., Franco, M., Ducret, A. & Mignot, T. Ein bakterielles Ras-ähnliches kleines GTP-bindendes Protein und sein verwandtes GAP bilden eine dynamische räumliche Polaritätsachse, um die gerichtete Motilität zu steuern. PLOS Biol. 8, e1000430 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Leonardy, S. et al. Regulierung des dynamischen Polaritätswechsels in Bakterien durch ein Ras-ähnliches G-Protein und sein zugehöriges GAP. EMBO J. 29, 2276–2289 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szadkowski, D., Carreira, LAM & Søgaard-Andersen, L. Ein zweiteiliger, Roadblock-Domänen enthaltender GAP-Komplex mit niedriger Affinität reguliert die bakterielle Vorne-Hinten-Polarität. MEHR Ginsterkatze. 18, e1010384 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szadkowski, D. et al. Die räumliche Kontrolle der GTPase MglA durch lokalisierte RomR/RomX-GEF- und MglB-GAP-Aktivitäten ermöglicht die Motilität von Myxococcus xanthus. Nat. Mikrobiol. 4, 1344–1355 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Keilberg, D., Wuichet, K., Drescher, F. & Søgaard-Andersen, L. Ein Reaktionsregulator verbindet das chemosensorische Frz-System mit dem MglA/MglB-GTPase/GAP-Modul, um die Polarität in Myxococcus xanthus zu regulieren. PLOS Genet 8, e1002951 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y., Guzzo, M., Ducret, A., Li, Y.-Z. & Mignot, T. Ein Protein zur Regulierung der dynamischen Reaktion moduliert die G-Protein-abhängige Polarität im Bakterium Myxococcus xanthus. PLOS Genet 8, e1002872 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leonardy, S., Freymark, G., Hebener, S., Ellehauge, E. & Søgaard-Andersen, L. Kopplung von Proteinlokalisierung und Zellbewegungen durch einen dynamisch lokalisierten Reaktionsregulator in Myxococcus xanthus. EMBO J. 26, 4433–4444 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaimer, C. & Zusman, DR Die phosphorylierungsabhängige Lokalisierung des Reaktionsregulators FrzZ signalisiert Zellumkehrungen in Myxococcus xanthus. Mol. Mikrobiol. 88, 740–753 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guzzo, M. et al. Ein durch FrzX vermittelter gesteuerter Relaxationsoszillator steuert morphogenetische Bewegungen in Myxococcus xanthus. Nat. Mikrobiol. 3, 948–959 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kapoor, S., Kodesia, A., Kalidas, N., Ashish & Thakur, KG Strukturelle Charakterisierung von Myxococcus xanthus MglC, einer Komponente des Polaritätskontrollsystems, und seine Wechselwirkungen mit seinem Paralog MglB. J. Biol. Chem. 296, 100308 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McLoon, AL et al. MglC, ein Paralog des GTPase-aktivierenden Proteins MglB aus Myxococcus xanthus, spielt eine unterschiedliche Rolle bei der Motilitätsregulation. J. Bakteriol. 198, 510–520 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wuichet, K. & Søgaard-Andersen, L. Evolution und Diversität der Ras-Superfamilie kleiner GTPasen in Prokaryoten. Genombiol. Entwicklung 7, 57–70 (2015).

Artikel Google Scholar

McBride, MJ, Köhler, T. & Zusman, DR Methylierung von FrzCD, einem Methyl-akzeptierenden Taxis-Protein von Myxococcus xanthus, korreliert mit Faktoren, die das Zellverhalten beeinflussen. J. Bakteriol. 174, 4246–4257 (1992).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bustamante, VH, Martinez-Flores, I., Vlamakis, HC & Zusman, DR Die Analyse des Frz-Signaltransduktionssystems von Myxococcus xanthus zeigt die Bedeutung der konservierten C-terminalen Region des zytoplasmatischen Chemorezeptors FrzCD für die Signalerfassung. Mol. Microbiol 53, 1501–1513 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Galicia, C. et al. MglA fungiert als Drei-Zustands-GTPase zur Steuerung der Bewegungsumkehr von Myxococcus xanthus. Nat. Komm. 10, 5300 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Baranwal, J. et al. Die allosterische Regulation einer prokaryotischen kleinen Ras-ähnlichen GTPase trägt zu Schwankungen der Zellpolarität in der bakteriellen Motilität bei. PLOS Biol. 17, e3000459 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miertzschke, M. et al. Strukturanalyse des Ras-ähnlichen G-Proteins MglA und seines verwandten GAP MglB und Auswirkungen auf die bakterielle Polarität. EMBO J. 30, 4185–4197 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mirdita, M. et al. ColabFold: Proteinfaltung für alle zugänglich machen. Nat. Methoden 19, 679–682 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, R. et al. Vorhersage von Proteinkomplexen mit AlphaFold-Multimer. bioRxiv, 2021.2010.2004.463034 (2021).

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levine, TP et al. Entdeckung neuer Longin- und Roadblock-Domänen, die Plattformen für kleine GTPasen in Ragulator und TRAPP-II bilden. Kleine GTPasen 4, 62–69 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Koonin, EV & Aravind, L. Dynein-Leichtketten der Roadblock/LC7-Gruppe gehören zu einer alten Protein-Superfamilie, die an der NTPase-Regulation beteiligt ist. Curr. Biol. 10, R774–R776 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Spang, A. et al. Komplexe Archaeen, die die Lücke zwischen Prokaryoten und Eukaryoten schließen. Natur 521, 173–179 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cherfils, J. Kodierung der Allosterie in der mTOR-Signalisierung: Die Struktur des Rag-GTPase/Ragulator-Komplexes. Mol. Zelle 68, 823–824 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bar-Peled, L., Schweitzer, L., Zoncu, R. & Sabatini, D. Ein Regulator der Rag-GTPasen, der mTORC1 Aminosäurespiegel signalisiert. Zelle 150, 1196–1208 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lawrence, RE et al. Ein nährstoffinduzierter Affinitätsschalter steuert die mTORC1-Aktivierung durch sein lysosomales Rag-GTPase-Ragulator-Gerüst. Nat. Zellbiol. 20, 1052–1063 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaiser, D. Soziales Gleiten korreliert mit dem Vorhandensein von Pili in Myxococcus xanthus. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 76, 5952–5956 (1979).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hodgkin, J. & Kaiser, D. Zell-zu-Zell-Stimulation der Bewegung in nicht beweglichen Mutanten von Myxococcus. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 74, 2938–2942 (1977).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, X. et al. Bioinformatik und experimentelle Analyse von Proteinen von Zweikomponentensystemen in Myxococcus xanthus. J. Bakteriol. 190, 613–624 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sambrook, J. & Russell, DW Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Edn. 3. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 2001).

Shi, W. & Zusman, DR Die beiden Bewegungssysteme von Myxococcus xanthus zeigen auf verschiedenen Oberflächen unterschiedliche selektive Vorteile. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 90, 3378–3382 (1993).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ: 25 Jahre Bildanalyse. Nat. Methoden 9, 671–675 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bulyha, I. et al. Regulierung der molekularen Pili-Maschine vom Typ IV durch dynamische Lokalisierung zweier Motorproteine. Mol. Microbiol 74, 691–706 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Friedrich, C., Bulyha, I. & Søgaard-Andersen, L. Outside-in-Assemblierungsweg des Typ-IV-Pili-Systems in Myxococcus xanthus. J. Bakteriol. Rev. 196, 378–390 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jakovljevic, V., Leonardy, S., Hoppert, M. & Søgaard-Andersen, L. PilB und PilT sind ATPasen, die antagonistisch in der Pili-Funktion vom Typ IV in Myxococcus xanthus wirken. J. Bakteriol. 190, 2411–2421 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iniesta, AA, Garcia-Heras, F., Abellón-Ruiz, J., Gallego-García, A. & Elias-Arnaz, M. Zwei Systeme für die bedingte Genexpression in Myxococcus xanthus, induzierbar durch Isopropylthiogalactopyranosid oder Vanillat. J. Bakteriol. Rev. 194, 5875–5885 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Paintdakhi, A. et al. Oufti: ein integriertes Softwarepaket für hochpräzise quantitative Mikroskopieanalysen mit hohem Durchsatz. Mol. Mikrobiol. 99, 767–777 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schumacher, D. et al. Die PomXYZ-Proteine ​​organisieren sich selbst auf dem bakteriellen Nukleoid, um die Zellteilung anzuregen. Entwickler Zelle 41, 299–314.e213 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ingerman, E. & Nunnari, J. Ein kontinuierlicher, regenerativ gekoppelter GTPase-Assay für Dynamin-verwandte Proteine. Methoden Enzymol. 404, 611–619 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Herfurth, M. et al. Ein nichtkanonisches Cytochrom c stimuliert die Calciumbindung durch PilY1 für die Bildung von Pili vom Typ IVa. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 119, e2115061119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sonn-Segev, A. et al. Quantifizierung der Heterogenität makromolekularer Maschinen durch Massenphotometrie. Nat. Komm. 11, 1772 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mirdita, M., Steinegger, M. & Söding, J. MMseqs2 Desktop- und lokale Webserver-App für schnelle, interaktive Sequenzsuchen. Bioinformatik 35, 2856–2858 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steinegger, M. et al. HH-suite3 für die schnelle Remote-Homologieerkennung und umfassende Proteinannotation. BMC Bioinforma. 20, 473 (2019).

Artikel Google Scholar

Madeira, F. et al. Such- und Sequenzanalyse-Tools-Dienste von EMBL-EBI im Jahr 2022. Nucl. Säuren Res. 50, W276–W279 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waterhouse, AM, Procter, JB, Martin, DMA, Clamp, M. & Barton, GJ Jalview Version 2 – ein Editor für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen und eine Analyse-Workbench. Bioinformatik 25, 1189–1191 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blum, M. et al. Die InterPro-Datenbank für Proteinfamilien und -domänen: 20 Jahre später. Nukl. Säuren Res. 49, D344–D354 (2020).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Hebditch, M. & Warwicker, J. Webbasierte Darstellung der Proteinoberfläche und pH-abhängiger Eigenschaften zur Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit von Biotherapeutika. Wissenschaft. Rep. 9, 1969 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Anna McLoon für die Generierung der α-MglC-Antikörper. GKAH und LS-A. danken der Max-Planck-Gesellschaft für die finanzielle Unterstützung.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Abteilung Ökophysiologie, Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, 35043, Marburg, Deutschland

Luís António Menezes Carreira, Dobromir Szadkowski und Lotte Søgaard-Andersen

Gruppe Evolutionäre Biochemie, Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, 35043, Marburg, Deutschland

Stefano Lometto & Georg. KA Hochberg

Fachbereich Chemie und Zentrum für Synthetische Mikrobiologie, Philipps-Universität, 35043, Marburg, Deutschland

Stefano Lometto & Georg. KA Hochberg

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung: LAMC und LS-A. Experimentelle Arbeit: LAMC, DS und SL Analyse experimenteller Daten: LAMC und SL Schreiben – Originalentwurf: LAMC und LS-A. Schreiben – Bearbeiten des Entwurfs: LAMC, DS, SL, GKAH und LS-A. Aufsicht: GKAH und LS-A. Fördermitteleinwerbung: GKAH und LS-A.

Korrespondenz mit Lotte Søgaard-Andersen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Beiyan Nan und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Carreira, LAM, Szadkowski, D., Lometto, S. et al. Molekulare Grundlagen und Designprinzipien der umschaltbaren Front-Hinten-Polarität und Richtungsmigration in Myxococcus xanthus. Nat Commun 14, 4056 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39773-y

Zitat herunterladen

Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 28. Juni 2023

Veröffentlicht: 08. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39773-y

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.